中华绒螯蟹Na+-K+-Cl-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析

杨志刚，周俊宇，朱靓亮，成永旭，夏冬梅

(1.上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2.上海海洋大学 农业部鱼类营养与环境生态研究中心，上海 201306；3.福建省水产功能性饲料与养殖环境调控重点实验室，福建 漳州 363000)

Na+-K+-Cl-协同转运蛋白(Na+-K+-Cl-Cotransporter, NKCC)是一种电中性离子跨膜转运蛋白，是氯离子共转运体家族的一员，在脊椎动物和无脊椎动物都有分布.NKCC能以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例对离子进行跨膜转运，广盐性鱼类能在不同盐度胁迫时进行渗透压调节，维持细胞离子平衡，调节细胞体积，进而维持细胞渗透压，在恶劣的环境中继续生存[1].研究表明，当鱼体处于高渗环境中，其机体NKCC基因被激活，向体外分泌离子，维持渗透压平衡[2].NKCC基因的全长序列在底鱂(Fundulusheteroclitus)、欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)、罗非鱼(Oreochromisspp)等被克隆且其表达随盐度变化上调[3-5].甲壳动物中，在日本囊对虾(Penaeusjaponicas)、拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等中克隆获得NKCC基因序列，并对其定位和在渗透压调节中的作用进行了研究[6-8].

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis,Es)广泛分布在我国长江中下游的河流和湖泊中，是一种具有增养殖前景的经济甲壳动物[9]，其具有一整套特殊的渗透压调节机制，能通过调节自身渗透压适应外界水体盐度变化[10-11]，但尚未见全长NKCC基因在中华绒螯蟹个体中功能的报道.本实验成功克隆获得在中华绒螯蟹渗透压调节中发挥重要功能的NKCC全长基因序列并进行生物信息学分析，研究高盐度胁迫下不同时间点NKCC基因的表达，可为深入研究甲壳动物离子通道与渗透压调节机制积累基础资料.

1 材料与方法

1.1 材料

从上海海洋大学崇明基地捕捉体重130g左右的雄性中华绒螯蟹，在水泥池中暂养一周后用于实验.随机选取6只健康个体取后3对鳃用于cDNA克隆，另取肠、脑神经节、胸神经节、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清并迅速保存在液氮中用于组织定量表达.

TRIzol Reagen购自Invitrogen公司，2×Taq PCR MasterMix、DNA胶回收试剂盒、RNA保存液和大肠杆菌E.coliTop10感受态细胞购买自天根生化科技(北京)有限公司，5×PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq Kit和PMD-19T购自TaKaRa公司，SMARTer®RACE 5’/3’Kit购自Clontech公司.

1.2 引物设计

以中华绒螯蟹转录组中与NKCC基因高度相似的unigene为模板使用NCBI的Primer-BLAST设计中间片段扩增引物(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).克隆获得NKCC基因cDNA片段.使用Primer-BLAST分别设计3’端和5’端扩增引物.利用获得的中华绒螯蟹NKCC基因全长，设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物.以中华绒螯蟹18S-RNA基因作为内参基因.实验所有引物(表1)合成以及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

表1 实验所用引物及其序列

1.3 中华绒螯蟹NKCC基因全长cDNA的克隆

根据TRIzol Reagen试剂盒(Invitrogen)说明书提取中华绒螯蟹鳃总RNA.取5μL用于琼脂糖凝胶电泳(1%质量分数)检测，使用紫外分光光度计测定总RNA的质量和浓度.根据PrimeScript RT Master Mix(Cat.No.RR036A, TaKaRa)说明书反转录合成第一链cDNA.使用4对引物对合成的cDNA进行扩展.根据2×Taq PCR MasterMix试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明书中的反应条件和反应体系进行PCR扩增反应.使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并对符合大小的条带进行回收.根据天根DNA胶回收试剂盒说明书步骤对产物回收.纯化后的片段与PMD-19T(TaKaRa)载体连接，连接产物转化E.coliTOP10感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司).挑取阳性克隆产物进行菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳验，然后测序.5’和3’RACE分别按照SMARTer®RACE 5’/3’Kit试剂盒(Clontech)配制50μL反应体系，根据说明书步骤进行扩增.

1.4 生物信息学分析

利用VecScreen(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)克隆测序的序列在线软件对克隆测序的序列进行去载体，得到目的片段序列，将核心片段和RACE片段拼接获得中华绒螯蟹NKCC基因cDNA序列全长.利用NCBI ORFfinder在线工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测中华绒螯蟹NKCC基因的开放阅读框.利用ProParam(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)和NetNGlyc 1.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/)分析蛋白质的理化性质.使用NCBI Protein BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对中华绒螯蟹NKCC进行结构分析.利用DNAMAN和MEGA 5.0软件对序列进行多重比较和构建进化树.

1.5 中华绒螯蟹NKCC基因组织表达分析

通过SYBRPremixExTaqKit试剂盒实现荧光定量，在ABI 7500实时荧光定量PCR系统上进行.利用10倍梯度稀释的cDNA模板制作引物的相对标准曲线，确定模板合适的浓度以及反应条件.通过相对标准曲线分析，当退火温度设置为62℃，退火时间设置为45s时，扩增引物效率可达到100%±5%；同时cDNA模板稀释倍数为10时，扩增Ct值处于合适范围.取中华绒螯蟹的肠、脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清进行荧光定量，为减少实验误差，每个组织取5个生物学重复样品，每个生物学样品进行3次技术重复.根据SYBR Premix Ex Taq Kit试剂盒配制反应体系.反应程序为两步法PCR扩增标准程序：95℃ 30s；95℃ 5s，62℃ 45s，共扩增40个循环；溶解曲线分析程序为：95℃ 15s，65℃ 60s，95℃ 30s.采用2-ΔΔCt法用Excel2013软件分析目的基因的相对表达量.

1.6 中华绒螯蟹NKCC基因高盐度不同胁迫时间表达分析

盐度胁迫实验在上海海洋大学立架式循环水养殖系统中进行.实验分为海水组(Sea Water, SW)和淡水组(Fresh Water, FW)，每个实验组设置3个重复，每个重复20只蟹.SW用海水晶配制水体盐度为25‰.FW组用曝气后的自来水，盐度为0.中华绒螯蟹暂养7d后，挑取健康、附肢完整的个体用于实验.将实验蟹至于立架式循环水养殖系统的玻璃缸(40cm×40cm×60cm)中，缸底铺细沙并放至瓦块等用于隐蔽.实验过程中不进行投喂，光照周期为12h光照/12h黑暗，每天对水质参数进行两次监测，水体温度保持在24.5～30.0℃，pH值为(8.0±0.4)，ρ(DO)>5mg/L，ρ总氨氮<0.01mg/L.分别取盐度胁迫0，3，6，12，24，48，72，96，122，144h中华绒螯蟹肠组织和血清，并迅速至于液氮中保存.中华绒螯蟹肠组织进行qRT-PCR，18S rRNA基因被用作内参基因.使用PrimeScrip RT试剂盒，以1μg RNA为模板合成cDNA第1链.qRT-PCR的反应体系为10μL 2×SYBR Premix Ex Taq(Cat.No.RR420A; TaKaRa)、0.2μmol/L引物、2μL cDNA模板.反应在ABI 7500实时荧光定量PCR系统(Life Tech, Applied Biosystems)上进行.为减少实验误差，每个时间点取3个生物学重复，每个生物学重复做3次技术重复.

1.7 高盐度不同胁迫时间中华绒螯蟹血清渗透压及血清离子变化分析

使用微型匀浆器(T10B，德国IKA公司)对1.6节中解冻后的血清进行匀浆，4000r/min下匀浆2～3min，然后于4℃、12000r/min离心20min，取出上清液备用.取50μL血清用冰点渗透压测定仪(OSMOMAT 030，德国Gonotec公司)测定血清渗透压，用超纯水将血清稀释2倍后用电解质分析仪(K-Lite5，广东梅州康立高科有限公司)分别测定Na+、Cl-浓度.

1.8 统计分析

数据统计分析采用SPSS 22.0进行单因素方差分析(ANOVA)，并进行Duncan’s多重比较分析各组间差异的显著性，显著水平为P<0.05.

2 结 果

2.1 中华绒螯蟹NKCC基因克隆及序列分析

以中华绒螯蟹NKCC基因cDNA为模板克隆得到全长序列，将测序结果进行拼接对比获得中华绒螯蟹NKCC基因全长.该基因的cDNA全长为4127bp，其3’端序列长944bp，5’端序列长18bp，ORF序列长3165bp.3’端包含典型的加尾信号序列(AATAAA)和31bp的poly(A)序列.

通过序列分析发现中华绒螯蟹NKCC基因的ORF共编码1054个氨基酸.预测分子量为116.102kDa，理论等电点为5.87.Leu和Ala含量最高，分别占11.8%和8.0%.总负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)为102个，总正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)为89个，不稳定性指数32.80，证明该蛋白质分类为稳定的.脂肪族氨基酸指数为97.89，表明该蛋白具有较高的耐热性.总平均疏水指数为0.059，表明该蛋白为疏水蛋白.利用NetNGlyc 1.0预测显示中华绒螯蟹NKCC蛋白的N端不存在信号肽，为非分泌蛋白，预测NKCC为一类跨膜糖蛋白，氨基酸序列中含有10个N-糖基化位点，在胞内和胞外区域均有分布.

利用ProParam预测该蛋白细胞定位为细胞质膜，可信度为31%，具有12个跨膜结构域.通过NCBI蛋白质BLAST对中华绒螯蟹NKCC氨基酸序列进行分析(图1)，结果表明在663～1054氨基酸残基之间有一个典型的Na+-K--Cl-共同转运蛋白SLC12A结构域.在51～1054氨基酸残基之间有一个典型的K+-Cl-协同转运结构域.

图1 中华绒螯蟹NKCC全长序列及推导的氨基酸序列

2.2 同源性分析及进化树分析

利用NCBI对中华绒螯蟹NKCC基因编码的氨基酸序列进行BLAST，获得多条与中华绒螯蟹NKCC基因具有较高同源性的其他物种NKCC氨基酸序列，利用DNAMAN对上述氨基酸序列进行多重序列比对分析，比对结果示于图2(第88页).结果表明：中华绒螯蟹NKCC氨基酸序列与拟穴青蟹NKCC同源性为86.17%，与三疣梭子蟹、可口美青蟹、日本囊对虾、夏威夷红虾(Hawaiian Red Shrimp)和普通滨蟹(Carcinusmaenas)的同源性分别为85.44%，85.77%，77.28%，77.69%和85.92%(图2).

图2 中华绒螯蟹NKCC和其他物种NKCC氨基酸序列多重比对

利用MEGA5软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)将中华绒螯蟹NKCC基因与其他物种的NKCC基因构建系统进化树.从系统进化树可以看出中华绒螯蟹NKCC首先与拟穴青蟹、三疣梭子蟹、可口美青蟹、蓝蟹聚为一支，再与夏威夷红虾和日本囊对虾聚为一支，而与小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)等脊椎动物同缘关系较远(图3).

2.3 中华绒螯蟹NKCC基因不同组织表达分析

中华绒螯蟹NKCC基因在所检测的肠、脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清中均有表达.由图4可以看出，中华绒螯蟹NKCC基因在肠中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)；其次为脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺；在肌肉、眼、心脏和血清中的表达量较低且没有显著性差异(P>0.05)(图4).

图4 NKCC mRNA在中华绒螯蟹各个组织中的相对表达量

2.4 高盐度下不同胁迫时间中华绒螯蟹NKCC基因表达分析

分析了高盐胁迫下NKCC基因在中华绒螯蟹肠组织中不同胁迫时间的表达模式(图5).研究结果表明，高盐胁迫后0～3h，NKCC表达量显著下降(P<0.05)，6h表达量上升，随后12～48h，NKCC表达量显著降低(P<0.05)，并在72h显著上调(P<0.05)，在96～144h，NKCC表达量变化不大，但显著低于0h和72h(P<0.05).

图5 高盐度不同胁迫时间NKCC基因表达分析

2.5 高盐度下不同胁迫时间中华绒螯蟹血清渗透压血清离子变化分析

测定了中华绒螯蟹在高盐胁迫下不同时间Na+，Cl-的含量变化及血清渗透压变化(图6，图7).研究结果表明，高盐度胁迫下，中华绒螯蟹血清Na+和Cl-含量都呈现先上升后下降的趋势.Na+的含量在72h达到最高然后开始下降，Cl-的含量在24h达到最高然后开始下降；高盐度胁迫下，中华绒螯蟹血清渗透压在0～6h显著上升(P<0.05)，在6～72h呈现缓慢上升的趋势，然后再72～144h略有下降，但变化不显著(P>0.05).

图6 高盐度不同胁迫时间血清Na+和Cl-变化

图7 高盐度不同胁迫时间血清渗透压变化

3 讨 论

NKCC属于电中性阳离子转运家族，预测的中华绒螯蟹NKCC基因序列包含了电中性阳离子转运家族的特征结构域[12-14]，这与日本囊对虾的研究结果相似[6].氨基酸序列分析结果显示中华绒螯蟹NKCC蛋白的N端不存在信号肽，为非分泌蛋白，该蛋白细胞定位为细胞质膜.具有12个跨膜结构域，为一类跨膜糖蛋白，氨基酸序列中含有10个N-糖基化位点.已有研究表明，所有NKCC都是糖蛋白[15]，NKCC基因的TM7和TM8的胞外环具有糖基化位点，而NKCC基因TM7和TM8的胞外环糖基化与细胞的转运功能密切相关[16].本实验通过RACE技术和基因克隆技术克隆成功得到中华绒螯蟹鳃的NKCC基因全长cDNA序列，系统发育分析表明，其与甲壳动物NKCC聚为一个分支，与高等脊椎动物明显分开.通过基因序列比对，发现中华绒螯蟹NKCC基因与拟穴青蟹、三疣梭子蟹、日本囊对虾的NKCC基因序列有高度同源性，证明NKCC基因在甲壳动物中高度保守，这与在梭子蟹中的研究结果相似[11].通过基因序列分析，发现在639～1054氨基酸残基之间有一个典型的SLC12A结构域.在51～1054氨基酸残基之间有一个典型的K+-Cl-协同转运结构域.

为揭示NKCC基因在中华绒螯蟹中应对盐度胁迫过程中的作用机制，本研究比较分析了高盐胁迫处理下中华绒螯蟹各组织中NKCC基因表达量的变化情况.通过对中华绒螯蟹组织定量分析发现，NKCC基因在各个组织均有表达，在肠中表达量最高，其次是脑神经结，这与日本囊对虾[6]和罗非鱼[5]中NKCC在鳃中的表达量最高不同.中华绒螯蟹后鳃是离子转运的主要场所，其有许多明显的离子转运上皮超微结构，离子转运型上皮有大量的离子转运通道，如Na+-K+-ATP酶和V-ATP酶等.这些离子通道通过线粒体供能完成转运离子及维持机体渗透压稳态[17].中华绒螯蟹NKCC在鳃中的表达明显低于肠道，这说明高盐胁迫对肠道中NKCC基因的表达影响更为显著.肠道作为消化、吸收营养物质的主要场所，同时也是渗透压调节的关键组织[18]，在应对外界刺激的过程中起到至关重要的作用.在对萨罗罗非鱼的渗透压研究中发现，萨罗罗非鱼在适应高盐度环境时，水通道蛋白在肠道中的表达量升高，参与了肠道的水分吸收[19].在对中华绒螯蟹肠道围食膜的研究中也有类似发现，中华绒螯蟹围食膜由上皮细胞分泌而成，分泌蛋白包含Na+-K+-ATP酶、ATP合酶、肌动蛋白、微管蛋白等，其可能参与免疫、渗透压调节及营养物质运输等过程[18].本研究中NKCC在中华绒螯蟹肠道中的表达显著高于其他组织，说明相对于其他部位，中华绒螯蟹肠道组织发挥了重要的渗透压调节作用.

本研究发现，随着盐度胁迫时间的延长，中华绒螯蟹血清中的Na+和Cl-先呈现上升趋势，分别在24h和72h达到最高水平，随后呈现下降趋势，并在96h后逐渐恢复稳定.相比于对照组而言，中华绒螯蟹血清渗透压先呈现显著上升，在72h达到最高水平，然后有所下降，并在96h后保持稳定的趋势.表明：为应对高盐度胁迫，随着中华绒螯蟹血清渗透压的显著改变，血清Na+和K+浓度也发生显著变化，Na+和K+在中华绒螯蟹渗透压调节中具有重要的作用.随着高盐度胁迫，中华绒螯蟹肠NKCC基因的表达量先是在3h内显著下降，并在胁迫48h下降到最低水平，然后在72h其表达量又显著上升并逐渐保持稳定的趋势.表明：中华绒螯蟹NKCC能在短时间内响应外界渗透压的变化，进一步证明其参与了机体渗透压的调节.鱼类上的研究表明，NKCC基因有两个亚型，分别是NKCC1和NKCC2.NKCC1是分泌亚型，在包括渗透调节器官在内的各个组织中均有表达，主要向细胞外分泌离子.NKCC2是吸收亚型，主要在肾脏和肠中表达，负责从外界吸收离子[5].然而，本研究克隆得到的序列信息不足以确定中华绒螯蟹NKCC基因是哪种亚型.其次，甲壳动物是否像高等脊椎动物那样存在两种NKCC亚型也尚需要进一步研究.