MicroRNA在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染过程中的作用

方满新，刘 犇，胡 威，潘耀谦

(1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000；2.新乡学院生命科学与基础医学学院学院，河南新乡 453000)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于尼多病毒目、动脉炎病毒科中的一种单链RNA病毒，基因组全长15.4 kb，包含至少11个开放阅读框(ORFs)，即ORF1a,ORF1b,ORF2a,ORF2b,ORFs3～7,ORF5a,ORF2TF，其中ORF1a和ORF1b编码2个大多聚蛋白pp1a和pp1ab，其经过水解为至少16个非结构蛋白(Nsps)；ORF2a,ORF2b，ORF3～ORF7 编码结构蛋白[1]。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRSV引起的一种免疫抑制性疾病，自20世纪80年代首次暴发以来，一直是养猪业的主要威胁，每年给世界养猪业造成了严重经济损失。

MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，长度21 nt～24 nt，在基因表达转录后调控过程中通过与受其调控的靶 mRNA的3’非编码区(3’UTR)互补结合，降解靶基因mRNA或抑制mRNA翻译发挥作用[2]。关于miRNA在PRRSV感染及复制等过程中的功能已有很多研究，miRNA与PRRSV有很紧密的调控关系。对这些方面的研究进展做一综述，以期为深入研究miRNA在PRRSV防控中的应用提供参考。

收稿日期：2020-06-19

基金项目：宜春学院博士科研启动项目(210-3360119046)

作者简介：方满新(1982-)，男，河南信阳人，讲师，主要从事动物病毒感染与非编码RNA互作研究。*通讯作者

1 miRNA参与PRRSV感染后的免疫反应调节

miRNA在调节细胞发育过程和免疫应答中起着重要作用。研究人员对于PRRSV感染后miRNA调控作用做了大量研究，以了解PRRSV与miRNA之间的相互作用。对PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)中miRNA表达谱研究发现，miRNA参与调节免疫信号通路、炎症反应、细胞因子信号、Toll样受体信号和钙代谢[3]。检测高致病性PRRSV(WUH3)感染Marc-145细胞时miRNA和免疫相关基因的表达，表明miRNA和免疫相关基因在PRRSV感染的Marc-145细胞中的表达受到调控并在免疫反应中有重要作用，提示miRNA是PRRSV复制和宿主免疫应答重要调节因子[4]。说明miRNA的表达受到PRRSV感染的影响调控，为揭示miRNA在免疫应答和发病机制中的作用奠定了基础。

通过小RNA测序研究PRRSV感染的通城猪和长白猪肺组织miRNA表达，以鉴定与宿主免疫反应有关的miRNA，在长白猪肺组织中有6个miRNA在不同时间点显著下调，在通城猪的miR-22-5p的显著上调被认为参与了PRRSV感染的特异性应答。另一方面，为了阐明通城猪相对于大白猪具有更强的抗PRRSV机制[5]，分别对通城猪与大白猪体内感染PRRSV的PAMs中miRNA表达谱和非编码RNA(包括miRNA和lincRNA)差异表达进行研究[6-7]，共有182个已知的miRNA被鉴定，其中23个上调差异表达的miRNA(DE miRNA)以及25个下调的DE miRNA，基因本体分析表明，DE miRNA靶基因富集在免疫应答、转录调控和细胞死亡。在对来自通城猪和大白猪PAM差异表达非编码RNA(包括miRNA和lincRNA)鉴定分析中共检测到250个已知的成熟miRNA，对于大白猪感染组有44个下调和67个上调miRNA，而通城猪感染组有12个下调和23个上调miRNA。在这2个品种猪的 DE miRNA靶基因在免疫相关过程中富集，包括凋亡过程、生殖反应、T细胞受体信号通路等。miR-378和miR-10a-5p可以抑制PRRSV复制，在通城猪对照组中表达水平高于大白猪对照组，相反miR-145-5p和miR-328在大白猪中特异性下调并靶向抑制性免疫受体，可能参与了PRRSV引起的免疫抑制，表明这些DE miRNA参与了2个品种猪免疫抑制和免疫逃逸调节。通过这几项研究PRRSV感染不同品种猪miRNA的差异表达，为进一步揭示宿主与病毒的相互作用提供了重要资料，为深入了解miRNA在PRRSV体内感染反应中的作用提供了新的思路,有助于开发新的抗PRRSV方法。

研究表明，PRRSV在感染初期对宿主免疫系统有抑制作用。聚肌胞苷酸(poly I∶C)是一种合成型双链RNA(dsRNA)类似物，在细胞中激活天然免疫反应及诱导细胞凋亡。用测序技术对poly-I∶C刺激和PRRSV感染的PAM进行miRNA表达分析，比较在固有免疫激活和失活状态下不同miRNA表达谱，结果表明PRRSV感染与poly-I∶C刺激的PAM相比，仅对宿主细胞miRNA的表达有轻微改变作用，证实PRRSV在感染早期可抑制宿主固有免疫应答[8]。在差异表达的miRNA中，ssc-miR-27b-3p能显著抑制Marc-145细胞和PAM中PRRSV复制。此外，PRRSV对猪原代PAMs早期感染过程中IFN-β蛋白有抑制作用，且中国高致病性PRRSV介导的抑制作用更强[9]；let-7b、miR-26a、miR-34a和miR-145能够通过直接靶向猪IFN-β的3′UTR抑制原代PAM中IFN-β蛋白表达，在体外早期受PRRSV感染的PAM中表达上调，并且HP-PRRSV JXwn06感染PAM的miRNA水平高于低致病性PRRSV HB-1/3.9感染PAM的miRNA水平。表明PRRSV在体外通过上调PAM中的细胞miRNA抑制IFN-β表达。

以上研究揭示了PRRSV与宿主的相互作用，提供了PRRSV感染过程中miRNA表达变化的宏观信息，表明PRRSV感染后不但会诱导宿主细胞miRNA的表达活性改变，同时功能分析显示miRNA在PRRSV感染后参与了机体炎症和免疫反应调节过程，为PRRSV介导的猪先天免疫调节机制研究提供了新的线索，但仍有很多问题亟待研究。如PRRSV感染后参与了机体炎症和免疫反应调节过程的miRNA，其确切功能及发挥机制如何？不同种的猪感染PRRSV后miRNA表达存在差异，其具体分子调控机制如何？如何使之在抗PRRSV中有应用价值?这些问题都有待于进一步深入探索。

2 miRNA参与PRRSV复制和感染的调控

在病毒和miRNA之间存在复杂的相互作用关系，miRNA在病毒的感染与复制过程中发挥了促病毒或抗病毒两种功能作用，通过总结分析，可以将参与调节PRRSV复制感染的miRNA根据其靶点分为3类，即直接靶向PRRSV基因组，靶向影响PRRSV复制的信号通路，靶向参与PRRSV复制的宿主因子。

2.1 miRNA促进PRRSV感染和复制

研究表明，miRNA在PRRSV复制中起促进作用，对PRRSV调节miRNA的表达进行研究，显示PRRSV通过调节Sp1的表达上调miR-373，而miRNA-373通过靶向核因子Ⅰ(NFⅠ A，NFⅠ b)、白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK1，IRAK4)和干扰素调节因子(IRF1)来抑制β干扰素(IFN-β)的产生，以促进体外PRRSV复制[10]。Ⅰ型干扰素(IFN)在抗病毒反应中起关键作用，病毒侵入细胞后，病毒核酸和其他病原体相关分子模式(PAMP)可被视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体和Toll样受体(TLR)等细胞模式识别受体(PRR)识别；随后TLR通过结合髓样分化因子88(MyD88)或含有衔接蛋白的Toll/IL-1受体结构域诱导IFN-β(TRIF)，而RIG-I或黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)通过结合其衔接蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)向TANK结合激酶1(TBK1)和IκB激酶ε(IKK-ε)传递信号；然后，TBK1/IKK-ε激活IRF-3、IRF-7、核因子kappa B(NF-κB)等转录因子，诱导Ⅰ型干扰素转录；最后Ⅰ型干扰素与细胞表面的IFN-α/β受体结合，最终诱导产生大量IFN刺激基因，从而抑制或消除病毒。miR-382-5p表达被PRRSV诱导上调，并能抑制Ⅰ型干扰素产生和促进PRRSV复制[11]，MiRNA-30c靶向干扰素-α/β受体β链，促进2型PRRSV感染[12]。

2.2 miRNA抑制PRRSV感染和复制

miRNA可以通过靶向病毒复制所必需的细胞基因或直接靶向病毒基因组以多种方式调控抑制PRRSV感染和复制。第1个确定的靶向miRNA的PRRSV基因组是miRNA-181，对PRRSV复制有极强抑制作用[13]；另一方面，有些miRNA靶向影响PRRSV复制的信号通路，miR-26a能抑制PAM中1型和2型PRRSV复制，其抑制效率高于miR-26b，荧光素酶报告结果证实miR-26a并不靶向PRRSV基因组，而是诱导Ⅰ型IFN表达并在PRRSV感染过程中上调IFN刺激基因MX1和ISG15[14]。此外，一些miRNA能够靶向PRRSV复制中涉及的宿主因子，非肌肌球蛋白重链9(MYH9)是PRRSV感染的重要因素，通过生物信息学预测和试验验证，MYH9表达受miRNA let-7f-5p调控，miRNA let-7f-5p与MYH9 mRNA 的3′UTR结合，抑制MYH9的表达从而显著抑制PRRSV复制[15]。其他研究有miR-c89及miR-10a-5p分别通过靶向宿主因子猪维甲酸X受体β和信号识别颗粒14抑制PRRSV复制[16-17]。

这些研究不仅揭示了PRRSV通过miRNA调控宿主因子作用机制，显示miRNA在PRRSV感染中的促进或抑制等不同功能作用，而且为预防控制PRRSV感染开辟了一条新的有效途径。虽然这方面的多数研究尚停留在实验室阶段，主要针对体外细胞进行，相信随着研究工作的深入开展及研究手段的不断更新，未来miRNA对PRRSV感染与复制的调控作用也将研究得更加深入，并进一步扩展到动物模型，对于成功防控PRRS将有帮助。

3 miRNA在PRRSV感染中的其他研究

关于PRRSV影响miRNA表达的研究是通过细胞系和仔猪进行，它们对病毒感染的反应可能不同于成年公猪，研究PRRSV感染公猪早期精子、精液和血清的miRNA表达谱，探讨在PRRSV感染的早期是否改变了特异性miRNA丰度，对感兴趣的miRNA的预测靶点进行功能富集分析，结果表明PRRSV感染确实导致所有组织中miRNA丰度差异，但是精子细胞中miRNA丰度差异最大[18]；KEGG分析鉴定显示P2X/P2×7通路在所有3种组织类型中均被鉴定到，表明PRRSV感染可引起miRNA丰度差异，进而影响精液质量并通过这一通路调节生殖能力。另一方面，因为宿主内环境稳态丧失可能意味着基因等表达谱的潜在变化，通过检测miRNA和tRNA差异表达以及它们的生物学通路探讨高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染对宿主体内稳态的影响，结果表明HP-PRRSV感染通过改变miRNA和tRNA的表达影响宿主稳态[19]。对猪乳外胞体中总miRNA提取，将提取的外胞体和总miRNA处理感染PRRSV的Marc-145细胞，结果表明转染猪乳外胞体和转染猪乳外胞体总miRNA细胞中的PRRSV滴度都显著低于转染PBS阴性对照，说明猪乳外胞体中存在与抑制PRRSV复制有密切关系的miRNA，为PRRS的预防和治疗提供新的理论依据[20]。此外，有研究报道胎盘细胞和猪子宫内膜上皮细胞凋亡是妊娠母猪繁殖失败的明显标志，但其作用机制尚不清楚。研究分离Sn阳性猪子宫内膜上皮细胞(PEC)，流式细胞术检测细胞凋亡率，随后对模拟和PRRSV感染的PEC的整个转录组进行比较鉴别，有54个差异表达的miRNA，104差异表达基因(DEG)、22个差异表达lncRNA(DE lncRNA)，主要富集在细胞凋亡、坏死和p53信号通路[21]。通过对差异表达miRNA和差异表达基因的整合分析，2个miRNA(ssc-miR-339-5p和ssc-miR-181d-5p)和5个基因(SLA-DQB1、THBS1、SLC3A1、ZFP37和LOC100517161)参与了凋亡信号，其中THBS1和SLC3A1主要与p53通路有关，功能分析显示miR-339-5p在PRRSV感染后PEC凋亡中起调节作用。这些研究进一步从不同细胞及组织，不同角度研究miRNA在PRRSV感染中的表达及功能作用，有助于拓宽对miRNA在PRRSV感染过程中的功能认识，并为阐明PRRSV的病理机制及研究miRNA在PRRSV感染与防控中的应用奠定了基础。

4 miRNA在抗PRRSV复制和感染中的应用

RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默机制，自从1994年RNAi作为一种天然的抗病毒机制被发现以来，它已经成为对抗各种病毒感染的可行策略。研究证明治疗性miR-181c可以降低感染HP-PRRSV猪的感染严重程度[13]。miR-181-mimics可通过特异性结合到病毒基因组，在体外强烈抑制PRRSV复制，尤其是用miR-181模拟物处理的HP-PRRSV株感染猪与阴性对照组相比，血液中病毒载量显著降低并且缓解了PRRSV引起的发热。这些结果表明宿主miRNAs在调节PRRSV感染及在RNA干扰(RNAi)介导的抗病毒治疗策略中的重要作用。在PRRSV基因组的5′非翻译区(bps 155-162)中发现了miR-130潜在结合位点，鼻腔接种miR-130b的仔猪在体内表现出抗病毒活性，部分保护仔猪免受HP-PRRSV株vJX143的致命攻击，表明miR-130家族在调节PRRSV复制中的重要性，为细胞miRNA在抗PRRSV感染中的应用提供了科学依据，尤其是动物试验的研究为了解宿主与病原体的相互作用以及开发治疗病毒感染的方法开辟了新的途径[22]。miRNA在转录后水平上参与基因调控，并通过与具有高度互补性的靶位点结合而实现mRNA沉默。因此将宿主miRNA识别序列克隆到RNA病毒基因组中是控制病毒复制的合理策略。对PRRSV感染后体外培养的Marc-145细胞进行了深度测序，获得了小RNA(sRNA)的表达谱并选择了6个不同丰度的候选miRNA(miR-21、miR-140-3p、miR-185、miR-26a、miR-505和miR-199a)进行进一步研究，通过构建PRRSV突变体人工提供了与内源性miRNA序列完全互补的结合位点，结果表明高丰度miRNA靶向突变体对病毒的转录和复制均具有抑制作用，尤其是含有miR-140靶点的突变体(v140-t)在体外对病毒复制有较强的抑制作用，这对利用细胞内源miRNA抑制PRRSV复制的策略进行了有益探索[23]。

另一方面，人工miRNA(amiRNA)是利用天然miRNA生成和作用原理，将天然miRNA的成熟序列替换成人工设计的靶向其他感兴趣基因的反义序列，其以一个或多个特定基因为靶标，通过天然miRNA的生成和作用途径达到RNAi的效果，具有高效、作用迅速、特异性强等优点，有广阔的应用前景。唾液酸黏附素(Sn)和CD163是 PAM上2种 PRRSV细胞受体，用miRNA设计工具预测靶向Sn或CD163受体的候选miRNA，并通过转染每个amiRNA表达载体和报告载体的细胞进行验证，结果表明Sn-和CD163靶向的amiRNAs具有抗PRRSV作用。这些研究朝着开发更有效的抗PRRSV策略迈出了一步，后续有效的在体研究及体内释放仍然是一个挑战，同时，靶向的准确性也是使之将来作为一种治疗手段所需要克服的问题[24]。

PRRS仍是养猪生产中的主要疫病之一，随着研究的不断深入，人们逐渐发现miRNA是介导病毒和宿主间博弈的重要工具，也越来越意识到 miRNA在PRRS诊断和防控中的潜在应用价值，开发和利用以miRNA为靶标的生物诊断标记物或治疗靶标，必然在将来PRRS防控中发挥更大的作用。