噬菌体在防治畜禽沙门氏菌感染中的应用

于 堃，曹中赞，万 明，卢立志，栾新红

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.浙江省农业科学院畜牧兽医所，浙江杭州 310000)

规模化养殖在养殖业中占有越来越重要的地位，较高密度的养殖环境给疾病的发生带来隐患，其中，细菌性疾病是严重影响养殖业发展的原因之一。抗生素的使用可以较好地预防和治疗细菌性疾病，促进养殖业的发展。另外，抗生素还可以参与调节动物肠道菌群，增加动物的抗病能力，提高饲料转化率和降低饲养成本等[1]。但是随着抗生素的广泛、不合理、过度的使用，细菌对抗生素也逐渐产生耐药性。对于临床严重感染的病例，抗生素已经无法发挥其抗菌抑菌的作用，从而造成养殖业的严重损失[2]。

噬菌体是一类可以感染细菌的病毒，是病毒中最为普遍、分布最为广泛的群体。通常情况下，充满细菌群落的地方，如饲养场、动物胃肠道等都可以找到噬菌体。噬菌体发现之初，人们就发现它可以用于抵抗病原微生物，但是随着抗生素不断发展和使用，噬菌体逐渐被忽视。当过度使用抗生素的弊端逐渐显现、超强耐药细菌不断出现时，研究者对噬菌体的研究工作又开始逐渐增多。而噬菌体的应用不仅仅局限于治疗人类疾病，同时发展到动物疾病的预防，种畜禽场和水产业细菌性疾病的净化，饲料和水源中细菌的清除及食品安全卫生等方面[3]。

沙门氏菌是一种革兰氏阴性胞内兼性厌氧菌，常寄居于人类和动物的肠道中，是一种常见的人兽共患病原菌，它不仅能够引起畜禽的各种疾病，还能够通过污染的畜禽产品，威胁人类健康。抗生素类药物的滥用，同样也带来沙门氏菌耐药性的逐年增强。因此，寻找安全、高效、经济的新型生物防控剂替代抗生素防治畜禽沙门氏菌感染是当今亟待解决的问题。为此，本文就噬菌体的生物学特性及侵染细菌的机制，以及在防控畜禽沙门氏菌感染中的应用情况展开综述，以期为使用噬菌体防控养殖业中的细菌性疾病提供理论参考。

1 噬菌体的生物学特性

噬菌体是大小为20 nm～200 nm的病毒，完全依赖细菌进行复制和增殖。最早是在研究痘苗病毒的变异株时发现菌落周围出现水样化变化,并定义为乳样斑，或称为噬斑[4]。噬菌体的命名和分类是根据国际病毒分类委员会(ICTV)和下属的古细菌病毒委员会(BAVS)共同完成[5]。自1959年以来，已有超过5100种噬菌体在电子显微镜下被检测到，大约4950个噬菌体(占96%)属于有尾噬菌体目，只有186个噬菌体(占3.6%)是立方体、丝状或多形性的[6]。噬菌体由蛋白质和核酸组成。根据噬菌体的蛋白质结构，可以分为无尾部结构的20面体、有尾部结构的20面体和线状体。迄今已知的噬菌体大多数是有尾部结构的20面体。噬菌体的核酸一般只有一种类型，DNA或RNA，大体上细分为ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA。而噬菌体的增殖一般分为5个阶段，即吸附、侵入、复制与生物合成、装配和释放。根据噬菌体的增殖特性可将其分为溶菌性噬菌体和溶源性噬菌体。凡在短时间内能连续完成以上5个阶段而实现其增殖的噬菌体，称为烈性噬菌体，也称为毒性噬菌体。溶源性噬菌体也称为温和性噬菌体，其吸附并侵入细菌后，不进行增殖，也不会引起宿主裂解，如大肠埃希氏菌λ噬菌体等[7]。

2 噬菌体侵染细菌的机制

噬菌体必须寄生在活菌内，并有严格的宿主特异性，这种特异性取决于它的吸附器官和宿主菌体表面受体的分子结构和互补性。噬菌体的增殖过程实际就是它侵染细菌的过程，共分5个步骤，主要包括吸附、侵入、复制与生物合成、装配和释放。吸附是指噬菌体的尾丝可逆或不可逆地吸附到宿主菌表面特异性受体上，这是病毒-宿主互相作用的第一步。吸附阶段决定了噬菌体-宿主的特异性和控制细菌对病毒感染抗性的机制。因为其特殊的结构，噬菌体不能主动吸附于细菌表面，所以可以适时加大噬菌体的浓度，加速它与细菌的碰撞，提高吸附率。当然，还有一些外部的非特异性因素，如温度30℃～42℃、pH5～7、部分噬菌体适当添加金属阳离子(如Mg2+和Ca2+等)，都会增加其吸附速率。吸附过程又分为可逆和不可逆的两种结合方式，吸附阶段的分子相互作用机制对于不同的噬菌体-宿主系统具有特异性，在不同分类群中可能也有较大差异。

侵入是指噬菌体将自身核酸成分注入到宿主菌的过程。一般情况下，核酸的渗透发生在不可逆吸附相之后，这一过程的机制是特定于每个噬菌体或噬菌体组。膜电位、ATP、肽聚糖层的酶分裂或这3个因素可能对细菌细胞内遗传物质的渗透至关重要[8]。以T4噬菌体为例，首先噬菌体的长尾丝可逆地吸附在细菌的表面，当3个或3个以上的尾丝吸附到菌体表面的时候，才能将噬菌体的核酸成分导入到菌体内[8]。一般噬菌体通过尾丝吸附到宿主菌表面后，噬菌体的基板结构发生改变，形成更加稳定的结构。在吸附过程以后，就会产生6条短纤维尾丝，不可逆的吸附到宿主菌表面的庚糖，从而进一步地吸附到菌体表面的核心多糖。基板构象改变的同时，展开的尾鞘收缩，中空的尾管穿透细菌的外膜，将噬菌体的核酸成分注入到菌体内部，噬菌体的中空尾管末端会形成溶菌酶和gp5蛋白，提高渗透作用，溶解细菌的细胞壁，使其产生小孔，导致细菌内物质漏出。但是正常情况下，小孔会很快被细菌修复[9]。

复制与生物合成是指注入到宿主菌的核酸会利用细菌的代谢机制来复制自身遗传物质达到生物合成的目的。以DNA为遗传物质的噬菌体，可以直接转录成mRNA，引导宿主菌的核糖体进行下一步蛋白质片段的合成。而以RNA为遗传物质的噬菌体，首先反转录成DNA，再按照DNA噬菌体的路径进行翻译和蛋白片段合成。

装配是将噬菌体的各个部件按照一定顺序组装成一个完整的噬菌体的过程[3]。翻译后期新合成的蛋白片段被组装起来，形成噬菌体的头部蛋白质亚单位、尾鞘、尾髓、基板和尾丝等部件，然后按照以下5个过程完成装配：头部的装配、尾部的装配、头与尾部结合、长尾丝装配。释放是指组装完成后的子代噬菌体裂解宿主菌的细胞壁释放出子代噬菌体的过程。这个过程不仅仅是噬菌体的增殖过程，也是裂解细菌的过程。

3 噬菌体在防治猪和牛等动物沙门氏菌病中的应用

猪霍乱沙门氏菌病在临床上极为常见，严重影响断奶前后仔猪的健康，导致较大经济损失。临床上一般使用药物治疗仔猪副伤寒，但随着人们对噬菌体认识地不断深入，已经有采用从粪便和污水中分离出的多种类型的噬菌体来防治养猪场沙门氏菌感染，并取得一定进展。从猪场粪便中分离到能有效裂解鼠伤寒沙门氏菌的烈性噬菌体制成噬菌体鸡尾酒，用于治疗感染鼠伤寒沙门氏菌的猪，发现该噬菌体制剂可以有效减少猪直肠中沙门氏菌的分离率，仔猪肠道中菌群减少，以直肠表现最明显，所以噬菌体在控制猪沙门氏菌上是一个可行的工具，但是进入实际应用还有待确定最有效的给药方案和最有效的噬菌体组合[10]。从107株沙门氏菌中共鉴定出34个血清型，同时分离出13株噬菌体，从中选出4株噬菌体制备4种含有不同噬菌体的噬菌体鸡尾酒，给4周龄仔猪口服，1周后给予鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)攻毒，采集肛门拭子检测，发现提前给予噬菌体的猪开始可以检测出较多沙门氏菌，之后沙门氏菌数量开始下降，直至检测不到，说明噬菌体在仔猪体内增殖定居，并开始复制，可以有效消除沙门氏菌[11]。显然，沙门氏菌特异性噬菌体鸡尾酒可能是控制猪沙门氏菌感染的安全有效的工具。

牛肉作为当今人们不可缺少的食物之一，但被沙门氏菌感染的无症状牛及其动物产品的运输和食用会引起很严重的食品安全问题。鼠伤寒沙门氏菌或都柏林沙门氏菌都可以引发牛沙门氏菌病。犊牛比成牛易感，常常表现体温升高、停食、腹泻带血等症状。从肉牛饲养场环境中分离沙门氏菌和沙门氏菌噬菌体，并进行噬菌谱检测，发现从粪便和土壤中分离出噬菌体的概率比从饲料和饮水中多。然而，要更全面地了解这些噬菌体的生物学特性，并推断它们的生活方式和可能的生态作用，需要对来自养殖场环境的单个噬菌体克隆进行表达，以探索噬菌体通过控制沙门氏菌来增强牛肉等产品安全的潜力[12]。

4 噬菌体在防治家禽沙门氏菌病中的应用

鸡作为沙门氏菌的主要宿主，一旦感染沙门氏菌，常常引起雏鸡大批死亡。成年鸡感染沙门氏菌虽然没有明显症状，但会影响产蛋率和生产性能。同时，隐性感染的个体往往会通过蛋类和禽肉作为媒介，引发人类食源性沙门氏菌病。美国学者通过对美国8个州一些家禽死亡原因调查得出，导致这些家禽死亡的主要病原菌就是沙门氏菌。试验证明口服接种噬菌体φ2.2可以提高对雏鸡感染鼠伤寒沙门氏菌的保护率。从鸭场环境中分离出4株噬菌体，对24株沙门氏菌都有良好的裂解作用，制成的噬菌体鸡尾酒用于生鸡胸肉抑菌试验，表明对肠杆菌的生长具有良好的抑制作用[13]。用不含毒力基因和抗性基因的噬菌体对患有鸡白痢的3日龄雏鸡进行治疗试验，治愈率达到50%。被多重耐药菌污染的鸡蛋也是危害人类健康和公共卫生安全的潜在隐患，因此越发需要控制多重耐药沙门氏菌的新方法[14]。从环境中分离出数株沙门氏菌噬菌体，从中挑选出一株裂解力最强、噬菌谱最广的噬菌体D1-2，可以有效抑制蛋黄和蛋白中污染的2株多重耐药沙门氏菌[15]。以上研究都说明分离出噬菌谱广、裂解力强的沙门氏菌噬菌体对鸡沙门氏菌病都有良好的控制和预防作用。

鸭沙门氏菌病又叫鸭副伤寒，是由沙门氏菌引起的一种急性败血性传染病。该病呈现地方流行性，主要感染3周龄以内的雏鸭，其中6日龄～10日龄为感染高峰期，1月龄以上的鸭感染则具有较强的抵抗力，一般不会引起死亡，而成年鸭往往不表现出症状；蛋鸭在产蛋过程中，鸭蛋会受到污染，因此造成死胚率升高[16]。同时，沙门氏菌可以通过水平传播和垂直传播，种鸭场一旦感染很难被清除，因此种鸭带菌也是本病暴发的主要原因之一。欧洲部分国家就曾发生过鸭蛋中携带鼠伤寒沙门氏菌的情况，并给养鸭业造成严重的经济损失。从鸭场中分离出1株沙门氏菌噬菌体，经检测发现，该噬菌体噬菌谱很广，可以裂解鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、阿哥纳沙门氏菌、迈阿密沙门氏菌、鸭沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌，且没有毒力基因和抗性基因[17]；选取鼠伤寒沙门氏菌攻毒，进行噬菌体保护试验显示，攻毒鼠伤寒沙门氏菌后，再接种噬菌体，噬菌体具有良好的防控鸭源沙门氏菌的效果。从鸭源沙门氏菌、巴氏杆菌和大肠埃希氏菌中分离出1株沙门氏菌噬菌体，体外试验证明该噬菌体可保持强裂解沙门氏菌能力长达3 h[18]。从鸭场下水道中分离出噬菌体，该噬菌体既可以裂解肠炎沙门氏菌，也可以分解部分肠内革兰氏阴性菌，食用被肠炎沙门氏菌污染的鸡可以通过给鸡饲喂肠炎沙门氏菌特异性噬菌体作为饲料添加剂来减少疾病的发生[19]。分离沙门氏菌的噬菌体SLMP1，原核表达获得重组裂解酶，可以裂解4种沙门氏菌血清型，即鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌，以及大肠埃希氏菌O157、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌等[20]。该裂解酶若是可以在家禽细菌性疾病中应用，将会很好地控制临床上细菌性疾病的发生。

鹅沙门氏菌病又叫鹅副伤寒，是沙门氏菌引起的一种急性或慢性传染病。鹅沙门氏菌病可以垂直或水平传播，且各个年龄段的鹅都易感，其中雏鹅最易感，常表现为死胚或者破壳后不久死亡。成年鹅抵抗力较强，一般没有临床症状，但会隐性带菌。从多家鹅场430份病料样本中分离获得107株沙门氏菌，感染率或隐性带菌率极高[21]。从4个鹅场中分离出的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，对四环素类、氨苄青霉素、链霉素具有极高的耐药性，鹅沙门氏菌病一般通过消化道或呼吸道传播，但也会通过垫料、饮水、食物等传播，同时还会通过其动物产品传染给人类，所以控制鹅源沙门氏菌是保护人类健康的关键之一[22]。在鹅源沙门氏菌的报道中，肠炎沙门氏菌占据了大多数，但总体来说相关报道比较少。因此，从鹅场分离出来的沙门氏菌噬菌体如果能够应用到防控鹅沙门氏菌病，将对养鹅业发展具有重大意义。

5 噬菌体防控细菌感染的优势和局限性

噬菌体在家禽养殖方面用于防控肠杆菌有诸多优点，且不存在耐药性的问题，因此在临床上具有广阔的应用前景。首先，噬菌体和细菌广泛存在于自然界中，与传统的抗生素相比，噬菌体的研发时间短、成本低，只需要简单的从细菌中筛选出来，找到其最佳感染复数，再辅以能发挥最好效果的加工工艺，噬菌体将会是很好的临床防控细菌性疾病的手段。其次，噬菌体具有专一性，口服摄入到消化道中不会引起菌群失调，或引起副作用和继发感染，同时，相对于抗生素需要多次给药才能达到治疗效果的前提来看，噬菌体可以单次给药就能得到良好的治疗效果[9]。再者，使用噬菌体治疗细菌性感染安全性较高，噬菌体主要组成成分就是蛋白质外壳和核酸，本身不具有毒副作用，且噬菌体也广泛存在于自然界，与动物共存，摄入噬菌体也是自然作用，并非是异源体[23]。最后，随着对噬菌体的研究不断深入，噬菌体的分离方法、检测方法不断被优化，噬菌体的生物学特性及作用机制也越来越清晰，这都为噬菌体进入正式临床应用提供理论基础。

尽管噬菌体在治疗细菌性感染方面有很多的优势，但也存在相对的局限性。一是安全性问题。部分溶源性噬菌体可以转导耐药基因blaCTX-M、mel和tetM在大肠埃希氏菌属、沙门氏菌属和志贺氏菌属间传播[24]，所以，并不是所有的噬菌体都可以用于治疗，且用于治疗的噬菌体除了有强裂解能力之外，不能含有毒力基因和抗性基因，安全系数高，且环境友好。二是噬菌体的噬菌谱。由于噬菌体有独特的专一性，所以用于临床使用的噬菌体必须有较广的噬菌谱。现阶段大多选择几种裂解效果好的噬菌体按比例混合，制成噬菌谱广的噬菌体鸡尾酒用于临床治疗。三是噬菌体给药方式的局限性。由于噬菌体独特的结构，所以缺少合适的给药方式，在治疗消化道感染的时候，口服噬菌体制剂会被胃液和肠道中各种消化酶破坏，所以开发耐消化液和消化酶的噬菌体制剂是亟待解决的关键问题[3]。四是沙门氏菌已经通过其毒力因子进化出了抵抗宿主物理屏障和抑制后续免疫反应激活的机制[25]，如产生IL-10和NO的诱导iNOS的表达，来抑制T细胞的表达；且存在于不同血清型沙门氏菌染色体和质粒中的23个编码沙门氏菌毒力相关基因的区域SPI通过多种机制，逃避宿主细胞免疫系统的识别和攻击，从而可以在体内生存和增殖。

6 展望

综上所述，在养殖实践中，利用噬菌体来代替抗生素的使用，具有良好的前景，而且一些噬菌体制剂已经在美国、加拿大等一些国家进入临床试用阶段，甚至英国已经研制出噬菌体DNA疫苗。

但由于有的噬菌体的噬菌谱较窄，加上其独有的特异性，从而无法达到广谱杀菌的作用。噬菌体独特的生物结构成分，如果直接进入体内，可能会被消化道直接消化或者引起机体免疫应答，导致其无法发挥作用。因此，在噬菌体的给药方式、制作工艺上需要做深入研究；再则，噬菌体有其独特的裂解细菌的机制，所以临床上确定噬菌体的给药剂量之前，需要充分试验来确保其良好的治疗效果；还有，宿主菌本身也存在抵御噬菌体的方法，例如能够合成DNA裂解酶来降解外来噬菌体导入细菌体内的基因片段，或剪切噬菌体注入细菌体内的病毒DNA，且细菌的CRISPER基因可以保留或记忆曾经外来的基因组片段，从而通过RNA干扰的方式来阻断外来病毒的复制，这也给噬菌体的应用带来一定的难度。因此，分离获得噬菌谱广且较安全的噬菌体、避免噬菌体产生毒力基因和抗性基因、良好的给药方式、恰当的给药剂量等都是以后研究的难点和热点。相信随着科技的发展，噬菌体有望成为一种真正的绿色、健康、高效的生物制剂，应用于畜禽养殖行业防控细菌性疾病，这将对整个人类和动物健康具有重要意义。