细小病毒反向遗传操作技术研究进展

赵永强，吴艳虹，韦 韬，丛 丽，岳志刚，肖家美，邵西群

(中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112)

反向遗传学与经典遗传学相对而言，经典遗传学是从生物的表型、性状的改变出发，研究其相对的基因特征，反向遗传学则从生物的基因着手，研究基因的改变对生物表型、性状的影响。反向遗传学操作技术已经广泛应用于各个领域，尤其是病毒的反向遗传学操作，狭义的反向遗传学仅仅是微生物的感染性分子克隆构建。病毒反向遗传学是通过体外构建DNA或者RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒DNA或者cDNA分子水平上对其进行基因敲除、置换等体外人工操作，也被称为“病毒拯救”[1]。许多病毒的反向遗传学系统已建立，成功实现体外病毒拯救。应用体外基因突变、基因插入或者缺失和基因置换来研究生物基因结构和功能都是在反向遗传学技术基础上实现的，目前研究较热的基因敲除、RNA干扰等等都是反向遗传技术的延伸。反向遗传操作技术在病毒上的应用，推动了基因缺失疫苗、标记疫苗的研制，构建嵌合体病毒、突变病毒等。

1 病毒反向遗传学研究的发展

1.1 RNA病毒的反向遗传操作技术

RNA病毒反向遗传操作技术是以构建RNA病毒的感染性分子克隆为基础的。由于RNA病毒自身遗传物质的不稳定，反向遗传学操作的核酸为DNA，因此，获得病毒全基因组序列的逆转录DNA成为该项技术的关键环节之一。正链RNA病毒的主要研究思路是用RT-PCR技术，采用“分段克隆”的方式，将病毒基因组各片段按原顺序依次克隆到复制严谨性较高的克隆载体上，通过载体构建将RNA聚合酶的启动元件插入病毒全长cDNA分子克隆中，同时在构建的载体上引入一处或多处沉默突变，便于鉴定拯救的病毒，体外转染易感细胞或侵染宿主，拯救出与亲代病毒相似的子代病毒[1]。逆转录DNA克隆的准确性和完整性是RNA病毒拯救的关键，决定着病毒拯救的效率。对于负链RNA病毒，其cDNA转录的RNA或者裸露的负链RNA不具有感染性，必须与依赖性聚合酶、核衣壳蛋白等形成核糖核蛋白复合体(RNP)才可以进行病毒的正常复制与衣壳蛋白的组装。因此，针对负链RNA病毒(如狂犬病毒)，构建感染性分子克隆不仅需要构建全长的cDNA质粒，还需要构建RNA复制酶的相关辅助质粒。

1.2 DNA病毒反向遗传操作技术

DNA病毒的反向遗传相对于RNA病毒发展得更早、更成熟，并且进步也相对更快一些。通常情况下，将病毒全长基因组克隆到载体上，然后转染进入合适的宿主，即可实现病毒的拯救[1]。许多DNA病毒反向遗传学平台都已经建立，如双链DNA病毒疱疹病毒、腺病毒，以及单链DNA病毒圆环病毒、细小病毒等，而对于有些DNA病毒,由于基因组存在特殊的结构，比如细小病毒末端存在ITR回文序列，其感染性克隆构建报道相对较少。

2 细小病毒反向遗传学技术概述

2.1 细小病毒基因组结构

细小病毒是线性、单链DNA病毒，无囊膜，基因组长约4 kb～6.3 kb，它是等轴对称DNA病毒中最小病毒之一，分子质量约1.5×103～2.0×103ku，G+C含量约为40%～50%，末端存在120 nt～550 nt的回文序列，这些回文序列可以折叠成发夹结构，病毒的3′端成Y型或者T型结构，5′端成U型结构，对病毒的复制起着至关重要的作用。X射线晶体学研究明确了细小病毒颗粒为20面体结构。大部分的细小病毒具有2种～4种病毒壳粒蛋白，而简短浓核病毒属(Brevidensovirus)和环星黑烟浓核病毒属 (Pefudensovirus)则有5种病毒壳粒蛋白 (VP1-VP5)。细小病毒有左、右两个开放阅读框(L-ORF、R-ORF)，其中L-ORF通过可变剪接编码非结构蛋白NS,R-ORF编码结构蛋白VP[2-3]。

细小病毒科又分为细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓核病毒亚科(Densovirinae)，细小病毒亚科可感染脊椎动物，广泛存在于脊椎动物体内，可感染猫科、犬科、猪科、牛科、鸭科、鼬科等动物，严重危害畜牧业养殖，而浓核病毒亚科可感染节肢动物。许多细小病毒由于没有适于体外培养的细胞系，如多种阿留申病毒，难以在体外传代增殖，所以其生物学特性的研究需要依靠反向遗传操作技术辅助完成。

2.2 细小病毒滚动复制机制

细小病毒主要为自主复制型病毒。因为细小病毒在宿主细胞核内进行复制，只有当宿主细胞进入S期时，病毒才会利用宿主 DNA 聚合酶和其他细胞成分，随着细胞增殖而复制。由于细小病毒基因组3′末端自我互补序列可以折叠的缘故，其DNA复制过程不需要环化或者 RNA 引物，是以其基因组3′末端发夹结构的3′-OH 做为病毒复制的引物、线性化 DNA 亲代链作为模板，合成基因组的互补链，形成复制中间体RF。NS1蛋白在复制早期生成，具有切割酶、解旋酶的活性[4]，切割亲代 DNA 链，再次暴露子代 DNA 链的3′-OH，复制得以继续，此时在NS1蛋白的解旋酶作用下，5′末端发夹结构发生解折叠，再次做为复制模板。最后，亲代链和子代链各自利用各自的回文结构形成末端 ITR。新的子代 DNA 既可包装衣壳形成病毒粒子，也可作为模板继续复制。这是细小病毒滚动复制的全部过程，其滚动式复制的特点：一是病毒基因组3′末端发夹结构发挥类似引物的功能，开始病毒复制；二是病毒复制中间体 RF 的两条链均可以作为下一轮复制的模板；三是病毒基因组3′和5′末端发夹结构会形成“Y”/“T”和“U”型结构，而不同种属的细小病毒末端基因组序列以及形成的发夹结构也存在差异[5]。高度变异的肉食动物阿留申病毒属不同毒种病毒的末端序列也存在差异，获知存在复杂结构的末端序列不易。

2.3 细小病毒反向遗传操作技术构建策略

由于细小病毒基因组末端存在稳定的回文发夹结构，不容易获取末端序列，导致克隆细小病毒全基因组存在很大困难。

目前，构建细小病毒全基因组感染性克隆通常分为三个步骤：首先，采用分段扩增的方法获得覆盖全基因组的多个DNA片段；然后，利用体外连接的方法，将各个DNA片段连接起来，克隆到载体上，获得全长基因组DNA；最后，将获得的全长DNA转染易感细胞，并对拯救病毒的毒力、感染性以及免疫原性进行验证。细小病毒亚科不同属的成熟病毒颗粒优先包装单股正链或负链DNA，对于细小病毒属(Parvovirus)，本属大多数成员的成熟病毒颗粒中主要为负链DNA，如水貂阿留申病毒(AMDV)颗粒中95%为负链，鼠细小病毒(MVM)颗粒中99%为负链，病毒颗粒中有1%～50%包装单股正链DNA；对于依赖病毒属(Dependovirus),包装正链DNA和负链DNA的成熟病毒颗粒比例相等，如腺相关病毒AAV、AAV2，红病毒属(Erythrovirus)的人细小病毒(B19V)与AAV相同。所以，将目的片段克隆到载体时，应注意目的片段属于正链亦或是负链，正链DNA和负链DNA连接到载体复制原点后的方向应该相反。

2.3.1 分段克隆 反向遗传操作技术的关键步骤是获得病毒全基因组克隆，许多研究者均采用分段克隆的策略，即将包含病毒全基因组的各个DNA片段依次克隆到载体上。同时在基因组合适的位置引入一处或者多处无义突变，便于鉴定和拯救病毒。细小病毒单链末端的回文发夹结构复杂，很难通过常规PCR技术进行扩增，研究者采用多种方法获得病毒基因组末端序列。水貂阿留申病毒(AMDV)细小病毒全基因组在1990年被第一次测通。随着PCR、测序技术和人工合成基因片段技术的成熟，一部分研究者通过末端变性后分段PCR，将末端发夹结构序列准确测序，并通过人工合成末端发夹结构序列。有研究根据人博卡病毒(HBoV1)复制过程产生的头-尾连接的结构，发现头-尾连接的头部结构中包含两段序列，这两段序列和牛乳头状瘤病毒(BPV1)的3′末端发夹结构中部分序列相同，于是根据头部序列设计下游引物，根据BPV1 3′末端序列设计上游引物，成功扩增出HBoV1 3′末端发夹序列，接着还发现头-尾连接处的尾部结构中也包含一段序列，该段序列被证实和犬博卡病毒(BoV)的5′末端发夹部分序列相同，因此他们推测HBoV1 5′末端发夹序列和MVC 5′末端发夹序列相似，因此针对该序列设计上下游引物扩增出HBoV1 5′末端发夹序列，并通过人工合成了末端发夹结构序列[6]。用人工合成法合成并克隆MEV基因组的3′末端(约220 bp)、5′末端(约200 bp)，然后用PCR技术分段扩增基因组中间序列，并通过重叠PCR进行连接得到中间序列约4 700 bp[7]。在两末端发夹结构处各设计2对引物，通过优化PCR反应条件使末端发卡结构变性，克服末端复杂结构，并通过分段 PCR成功扩增出CPV末端发夹序列，再连接 T 载体测序，最后通过人工合成末端发夹结构序列，将细小病毒全基因测序过程简化，更便于细小病毒感染性克隆的构建[8]；采用末端变性[9-10]，优化PCR反应条件，成功扩增出AMDV-BJ株末端发夹序列，与AMDV末端序列同源性高，获得FPV的末端发夹结构序列。有研究建立一种快速构建猪细小病毒(PPV)感染性克隆的方法[11]，采用分段扩增末端发夹结构序列并测序，然后人工合成末端序列连接到载体pBlueScript Ⅱ SK(+)。用人工合成两末端片段[12]，并组装到低拷贝质粒构建pKQLL(F1+F2)，然后设计2对分别带有Flag和His标签的引物来扩增中间区域序列，获得带有标签的F3和F4中间片段。在发夹结合的位置设计引物，采用PCR分段扩增末端发夹结构序列，对样品DNA进行变性预处理，使其发夹结构充分打开并保持单链形式，便于与引物结合，对有效引发扩增非常重要。另外，利用人工合成的方法，将3′和5′端单链发夹结构序列合成为dsDNA序列较短片段拼接连接载体更为准确、经济。

在构建番鸭细小病毒(MDPV)ZW株全长质粒时，将ZW毒株在鸭胚中大量繁殖，并利用差速离心和超速离心法纯化病毒，提取单链DNA病毒(ssDNA)，然后95℃保持5min再缓慢降温到55℃退火，以致形成双链型DNA(dsDNA)，最后利用XbaI酶切获得的dsDNA分别产生两段包含3′、5′末端ITR序列的亚基因片段[13]。

2.3.2 拼接全长DNA片段 获得覆盖细小病毒全长基因组的各个亚克隆以后，即可将其拼接组合成全长病毒基因组DNA的质粒。但应值得注意的是，细小病毒末端回文发夹结构对其复制过程起着至关重要的作用，因此在构建细小病毒感染性克隆时应获得完整的末端发夹结构序列，由于很难通过常规PCR进行扩增，有些研究者通过末端变性PCR方法克隆末端发夹结构，也有用人工合成末端发夹序列，然后通过无缝克隆技术将细小病毒病末端和中间非编码区序列连接起来。在拼接全长DNA片段时载体的选择也很关键，构建单链DNA病毒感染性克隆时应选择穿梭质粒作为载体，同时载体的拷贝数不应太高，在构建鹅细小病毒(GPV)全长质粒时[14]，最先选用高拷贝的质粒作为载体，但含有完整末端ITR全长质粒在E.coliSure 感受态细胞中表现出不稳定性，换用低拷贝的载体后则成功转入感受态细胞。穿梭质粒载体具有两个不同复制起点，可以在原核和真核细胞两个不同类群宿主中复制和表达，如pBluescript Ⅱ SK(+)载体，其具有pUC和f1(+)两个复制起始位点，pUC方向允许dsDNA在大肠埃希氏菌感受态细胞中进行复制，进入动物细胞后则利用f1(+)方向复制起点产生病毒ssDNA，类似病毒基因组进入细胞复制表达。

在拼接AMDV全基因组质粒时，选用pGEM3载体作为表达载体，用HindⅢ和EcoRⅠ酶对获得的含有3′末端片段的载体进行双酶切，产生两个粘性末端，同时用这两种酶对pGEM3载体进行双酶切，将含有3′末端的片段导入酶切后的pGEM3载体，然后用EcoRⅠ酶将导入3′末端片段的载体线性化，同时用EcoRⅠ酶切含有5′末端双链基因组序列的载体，最后将含有3′末端和5′末端的双链基因组序列进行拼接，并将完整的AMDV双链基因组序列导入pGEM3载体，即获得AMDV全长质粒。随着无缝克隆技术逐渐发展成熟，许多研究者开始采用无缝克隆技术进行全基因组序列的拼接，在构建MEV全基因组质粒时，选择pBluescript Ⅱ SK(+)载体作为表达载体，并将载体中的酶切位点改造为克隆所需的酶切位点，然后采用In-Fusion无缝克隆技术将人工合成的末端序列和中间非编码区序列进行无缝拼接，获得麻疹病毒(MeV)基因组全长序列，最后将其克隆到经过改造之后的pBluescript Ⅱ SK(+)载体上，获得MeV全长质粒[7]。根据GenBank上公布的CPV Y1毒株序列， 将人工合成的3′和5′端dsDNA序列和PCR分段扩增CPV/BJL1基因组约4 700 bp的中间区域序列，用重叠PCR技术将3个片段连接起来，成功获得CPV全基因组序列[15]。在拼接PPV全长质粒时也是用In-fusion无缝克隆技术[11]，将中间片段(PM)导入质粒p(FI)构建质粒p(FM+FI),最后将FⅡ片段导入质粒p(FM+FI)，即获得了全长质粒pPPV。克隆一株水貂阿留申病毒株(AMDV-125)全基因组，并将全基因组导入真核表达载体pcDNA3.1,该载体亦为穿梭质粒载体，构建了全基因核酸疫苗(pcDNA3.1-AMDV)，并在此基础上又构建了基因缺失疫苗，经验证此疫苗免疫水貂能产生AMDV抗体，起到部分保护作用[16]。另外，构建感染性克隆还需要选择合适的感受态细胞，目前常用的感受态细胞为E.coliHB101菌株。而在载体构建过程中，经常会遇到一些基因片段具有高度的重复，这类插入载体质粒中的基因由于被细菌的重组酶系统和限制内切酶识别作用，产生高频率插入基因的片段的缺失和重排，使其在细菌中扩增不稳定，因此，在质粒扩增过程可以尝试使用重组酶和限制性内切酶缺陷的大肠埃希氏菌菌株，如Sure菌株。选择pBBSmaI载体作为表达载体，pBBSmaI载体是经过在pProEX HTb载体中插入一系列酶切位点改造而来，所有的克隆工作是在E.coli感受态细胞中进行,成功构建了HBoV1全基因组质粒[6]。将构建的番鸭细小病毒FZ91-30全长质粒分别转入DH5α和Sure菌株中，结果发现阳性质粒能够在Sure细胞中稳定复制，而DH5α中的阳性质粒末端ITR发生了不同程度的缺失。说明Sure菌株是经过改造的特殊菌株，适用于有复杂结构的DNA片段的克隆，增强外源DNA的稳定性，提高克隆效率[17]。

2.3.3 病毒的拯救 构建病毒感染性分子克隆的关键步骤是获得病毒的全基因组克隆，但获得的病毒全基因组克隆需转染易感宿主细胞，进而实现病毒的拯救。在过去，构建的病毒全基因质粒主要通过借助磷酸钙或者DEAE-葡萄糖的生化方法转染进入培养的真核细胞中，通过磷酸钙介导的方法，将构建的MeV全基因组质粒导入CRFK细胞，成功拯救出病毒。现在，很多研究者采用脂质体介导方法转染易感宿主细胞，因为这种方法可以获得较高的转染效率，并且脂质这种类型的试剂能够介导所有类型的核酸转染进入各种类型的宿主细胞，用脂质体转染技术[6]，将构建的HBoV1全长质粒转染进入HEK293细胞，成功拯救出病毒；用脂质体介导的方法[7]，将构建的MeV全基因组质粒导入F81细胞，成功拯救病毒；采用脂质体介导的方法[15，18]，将构建的质粒导入F81细胞，分别拯救出AMDV和CPV。有研究尝试脂质体介导和电穿孔等转染细胞方法，结果发现采用细胞核转染系统(AMAXA Cell Line Nucleofector system)转染细胞效果最好，通过此方法将构建的B19全基因组质粒导入UT7/Epo-S1细胞，拯救出B19病毒。

3 小结

反向遗传操作技术为研究细小病毒生命活动过程中的各种调控机制，如病毒的复制及致病性分子机理，提供了一个重要工具，特别对体外难以培养增殖的细小病毒的生物特征研究。反向遗传操作技术通过体外基因的改造，对毒力基因的删除，还可以用于新型疫苗株的筛选，同时还可以引入分子标记以研制标记疫苗。还可以通过构建嵌合体病毒，进一步研究病毒的复制及致病机制。细小病毒反向遗传操作的构建策略总体分为三步，首先分段克隆覆盖细小病毒全基因组序列的DNA片段；然后将获得的各个DNA片段进行拼接，并与选择的穿梭质粒载体进行连接，获得加载病毒全基因组的质粒；最后用构建的病毒全基因组质粒转染病毒易感的细胞，拯救病毒，并验证病毒感染性克隆是否构建成功。总的来说，构建细小病毒感染性克隆的关键步骤在于获取病毒的全基因组，其中难点在于获得病毒3′和5′末端发夹结构序列，因此,开发有效克隆末端未知复杂结构序列的方法是顺利开展细小病毒全基因组序列感染性克隆构建的关键。