Keap1-Nrf2/ARE信号通路抗氧化机制及抗氧化剂的研究进展

熊款款，谭 磊，王爱兵，杨凌宸

(湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)

氧化应激是指动物机体受到有害刺激时，体内活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基 (RNS)等产生过多，超过机体对其清除能力，进而导致氧化还原系统失衡，引起细胞内脂质、蛋白质和核酸的氧化性应激，最终引发细胞凋亡和组织器官损伤[1]。研究发现，细胞抵御氧化应激的关键通路是Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)[2]。该通路具有解毒与中和作用，也正因为该通路调控的抗氧化酶系及Ⅱ相解毒酶可清除ROS等有害物质，因此Keap1-Nrf2/ARE可作为一个药物靶点，应用于炎症、癌症、糖尿病、呼吸系统疾病、神经退行性疾病等的预防和治疗。此外，与Keap1-Nrf2/ARE相关的抗氧化剂在许多氧化应激诱发的疾病中也表现出良好的预防及治疗作用，该通路的抗氧化作用因而备受国内外关注。

1 Keap1-Nrf2/ARE通路元件的结构

1.1 Keap1的结构

Keap1是由鼠胚胎cDNA文库里筛选出的一种新蛋白，该蛋白与果蝇的KELCH蛋白高度同源。Keap1蛋白的分子质量为69 ku，是KELCH家族的一种多区域阻遏蛋白，位于19p13.2位点上。该蛋白一般存在于细胞质中，是Nrf2的负调节器，通常锚定于胞浆肌动蛋白的细胞骨架上[3]。Keap1的蛋白质序列分成5个区域，共627个氨基酸，分别为N端区域 、BTB 区域、中间连接区域、 KELCH区域和C端区域。其中BTB 区域与Nrf2的结合力密切相关，并且负责介导Keap1蛋白的二聚化作用。这个区域的核心位点是Ser-104，该位点的突变会影响Keap1的二聚化，对Nrf2的结合产生干扰作用[4]。中间连接区域富含半胱氨基酸残基，是Keap1与ROS及RNS结合反应的区域，对氧化和核输出的信号较敏感。Keap1介导Nrf2泛素化的关键位点Cys273和Cys288也位于该区域，并参与氧化还原信号的传导。KELCH区域中有6个双甘氨酸重复序列，其中Keap1和Nrf2的Neh2区的胞浆内肌动蛋白结合位点位于KELCH区域，可使细胞核内的Nrf2保持在一个相对较低的水平[5]。

1.2 Nrf2的结构

Nrf2又称Nfe2l2，由Moi等人用β珠蛋白的基因启动子NF-E2的重复序列作为识别位点探针，在K592 cDNA文库中筛选分离获得。Nrf2蛋白的分子质量为66 ku，位于2q31位点，属于CNC(Cap-n-Collar)蛋白调节家族以及Bzip (basic leucine zipper)的转录因子。 Nrf2在未受诱导的正常细胞里代谢迅速，半衰期约为15 min～30 min。CNC家族中其他成员包括NF-E2、Nrf1、Nrf3、Bach1和Bach2，具有不同的生物学功能， Nrf2是该家族转录调节功能最强的蛋白[6]。

Nrf2蛋白可分为6个功能结构域，依次为Neh1～Neh6。Neh1可与Maf蛋白形成异二聚体并与ARE结合，诱导目标基因的转录与表达。Neh2位于N末端，其包含DLG和ETGE两个结合位点可与Keap1的KELCH结合，干扰Nrf2的转录活性。Neh3位于C末端，与CHD6结合可激活ARE相关基因的转录，并与细胞转录活性有关[7]。Neh4和Neh5处于Neh1和Neh2中间，当Nrf2进入细胞核时，依靠Neh4和Neh5及cAMP反应原件的共同作用，启动转录过程。Neh6的特点是非Keap1依赖的富含丝氨酸的Nrf2 降解调控，与Nrf2的负性调节有关。

1.3 ARE的结构

ARE又称亲电效应原件，位于许多细胞保护基因的启动子上游，是一种包含特定DNA序列的调节原件。ARE中有活性的区域为长度16个核苷酸的序列：5′-T(A/C)ANN(A/G)TGA(C/T)NNNGC(A/G)-3，N代表中间5个可变的核苷酸。当细胞受到氧化刺激时，Nrf2进入细胞核内与Maf形成异二聚体，激活ARE依赖的基因表达，发挥抗氧化损伤的作用[8]。另有研究证实，Nrf2和Bach1均可与ARE 结合，激活Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶基因表达，保护机体组织细胞。

2 Nrf2-Keap1/ARE信号通路抗氧化应激机制

2.1 Nrf2-Keap1/ARE信号通路的激活

在正常状态下，Nrf2以无活性的状态存在于细胞质中，然而Keap1与Nrf2形成的二聚体和胞浆中的肌动蛋白结合并被锚定在细胞胞浆中。它可通过泛素蛋白酶体途径快速分解，使Nrf2保持低转录活性。Nrf2-Keap1二聚体的解偶联为该通路抗氧化应激的关键步骤，调控其解偶联的机制主要有Keap1 构象改变和Nrf2磷酸化作用。

2.1.1 Keap1构象改变机制 当细胞受到刺激产生氧化应激时，ROS和RNS通过修饰Keap1的半胱氨酸残基，使Keap1构象改变，进而抑制Nrf2的泛素化，促进Nrf2的磷酸化，降低26S蛋白酶体对Nrf2识别能力，使Nrf2-Keap1二聚体解偶联，并促使Nrf2进入细胞核。Nrf2稳定增加并与ARE结合，这是Nrf2-Keap1二聚体的解偶联的经典方式。进入细胞核后的Nrf2先与Maf蛋白结合成异二聚体，再与ARE基因识别并结合，从而启动其下游抗氧化应激酶和Ⅱ相解毒酶基因的转录，编码产生抗氧化蛋白，达到抗氧化应激的作用。

2.1.2 Nrf2磷酸化作用机制 许多蛋白激酶通过诱导Nrf2的磷酸化介导Nrf2的转录调节活性[9]，如蛋白激酶C(PKC)[10]、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)[11]、细胞外信号调节激酶(ERK)[12]、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)[13]、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)[14]等，以上蛋白激酶途径均参与Nrf2-Keap1二聚体的解偶联，诱导Nrf2磷酸化，并参与对Nrf2的转录活性调控。

2.2 Nrf2-Keap1/ARE信号通路的关闭

当机体由氧化应激状态恢复至正常生理状态时，Nrf2从ARE上解离并且返回胞浆，通过泛素化后降解，从而主动关闭Nrf2通路，Nrf2再次保持在相对较低水平。解离后的Nrf2和其他蛋白结合完成最终对靶基因转录的调控，恢复细胞的内稳态。

2.3 Nrf2-Keap1/ARE信号通路调控的靶蛋白

在正常状态下，Keap1与Nrf2的结合使Nrf2处于抑制状态，而在外界氧化应激刺激下(如ROS或RNS)，解偶联后的Nrf2进入细胞核，与ARE相结合，启动下游的抗氧化酶，这些酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 醌氧化还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等[15]。

3 具有调节Keap1-Nrf2/ARE信号通路作用的抗氧化剂

3.1 天然植物多酚类

植物多酚是一种天然的抗氧化剂，可增强机体抵抗ROS或RNS的能力，但其抗氧化机制较复杂。随着天然多酚的分离纯化技术不断发展，更多的天然植物多酚类被发现，而且这些抗氧化剂均与Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关。目前主要的植物多酚类抗氧化剂有白藜芦醇、姜黄素、原花青素、槲皮素、茶多酚等。

3.1.1 白藜芦醇 白藜芦醇是一种存在于植物中的多酚类抗氧化素，有较强的抗氧化活性，可以保护肝脏、血管、神经系统。白藜芦醇可有效的清除羟基、超氧化物以及金属诱导的自由基，并在产生ROS的细胞中发挥抗氧化的能力。向母猪饲料中添加白藜芦醇(300 mg/kg)，发现其胎盘中Nrf2蛋白的表达水平提高，且Keap1蛋白的表达水平下降，证明了饲料中添加白藜芦醇可以达到激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路的效果[16]。另外，白藜芦醇可上调Keap1-Nrf2/ARE下游抗氧化基因的表达，其中包括过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px、SOD 和HO-1，从而有效地保护由肾脏高血糖介导的氧化损伤[17]。

3.1.2 姜黄素 姜黄素主要由2个酚官能团与β-二酮组成，通过直接清除ROS，缓解氧化损伤。在亚慢性镉污染的小鼠肾脏模型中，用姜黄素成功地诱导小鼠肾Nrf2蛋白的活化和表达，进而诱导其下游的靶基因表达，降低由镉导致的氧化损伤[18]。此外，姜黄素可提高肝脏中的Nrf2、HO-1基因及其蛋白的表达量，使Nrf2的入核量均显著增多，证明了姜黄素通过促进Nrf2的活化与转入，激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路下游靶基因。但目前姜黄素的代谢和化学性质相对不稳定，且细胞膜的通透性较差，从而导致动物口服姜黄素的生物利用度极低。鉴于姜黄素较强的抗氧化作用，可对姜黄素进行适当化学结构修饰，改善膜通透性差和生物利用度低等缺点，提高姜黄素的药用价值。

3.1.3 槲皮素 槲皮素存在于许多植物中，是一种黄酮类抗氧化剂，其具有抗氧化和清除自由基的功能。槲皮素不仅可以通过Keap1-Nrf2/ARE信号通路上调Nrf2和抗氧化基因HO-1的表达，而且可上调脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，从而降低脑部的氧化应激反应，加强学习记忆的脑功能[19]。此外，槲皮素还作为丙型肝炎病毒(HCV)治疗的辅助佐剂，干扰丙型肝炎病毒诱导的细胞氧化还原状态的调节，减少病毒复制，从而缓解氧化应激。

3.1.4 儿茶素 儿茶素是绿茶中所富含的抗氧化成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌及抗病毒等作用，儿茶素没食子酸酯(EGCG)是主要活性成分。研究表明，EGCG不仅可以增加Nrf2基因在细胞核中的水平，还可促进ARE的荧光素酶的基因的转录[20]。EGCG还可通过Akt和ERK1/2信号途径，来激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，诱导下游的抗氧化酶基因(HO-1和MnSOD)的表达，提高细胞的抗氧化能力。

3.1.5 其他 还有其他植物多酚也具备抗氧化功能，如金丝桃苷可通过促进Nrf2向细胞核转移，与Bach1竞争结合ARE，促进保护细胞蛋白的水平上调，最终发挥细胞保护作用[21]。在氧化应激状态下，葡萄籽原花青素(GSP)可降低Nrf2的mRNA的表达水平，并增加Keapl的mRNA的表达量减轻氧化应激对Keap1-Nrf2/ARE信号通路的影响[22]。丹酸酚、丹皮酚、染料木黄酮、黄芩素等均可作为Keap1-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化剂，增强机体抗氧化能力。

3.2 含硫化合物

3.2.1 异硫氰酸酯类 在十字花科的蔬菜中，惰性芥子油苷前体是异硫氰酸酯类的主要成分。进入动物体内后，惰性芥子油在肠道内转变为ITCs，而ITCs可与Keap1半胱氨酸残基中的巯基发生反应，干扰 Keap1和Nrf2的结合，刺激ARE调节靶基因产生抗氧化作用。异硫氰酸苯乙酯(PEITC)和萝卜硫素(SFN)是Keap1-Nrf2/ARE信号通路中异硫氰酸酯类主要的抗氧化剂[24]。SFN和PEITC可增加Nrf2活性和Nrf2依赖基因(NRF2-GCS、HO-1)的表达，诱导Nrf2依赖的抗氧化途径，而且该途径可能为SFN和PEITC保护人类皮肤免受氧化损伤和细胞凋亡的一个潜在分子机制[25]。研究证明用寡核酸芯片鉴定化学预防性PEITC是一种很有前途的化学预防药物，它通过激活Nrf2，从而诱导Ⅱ相酶发挥抗氧化作用[26]。SFN是一种从十字花科植物中提炼而出的异硫氰酸盐，有着很强的抗氧化作用，它可通过上调Nrf2的表达达到抗炎和抗氧化的作用。而且SFN对肾脏、肝脏局部缺血导致的氧化应激损伤也有保护作用。另外，在与氧化应激相关的口腔癌变中，SFN也发挥重要的预防作用。

3.2.2 邻二硫醇类 1，2-乙二硫醇和 2，3-二巯基琥珀酸可以在动物体内转变为二硫键，而二硫键具有亲电性质，可以激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路[27]。(R)-硫辛酸是邻二硫醇类的一种变体，在许多的食物中均可内源产生，其中以菠菜和花菜中的含量最高。(R)-硫辛酸被证实可通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，诱导其下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达[28]。

3.2.3 二硫醚和二烯丙基硫化物 二硫醚是一种五元环状含硫化合物，有抗氧化和抗癌的作用。其中3H-1，2-二硫-3-硫酮(D3T)是一种简单的二硫醚化合物，存在于十字花科的蔬菜中。D3T可作为一种抗氧化剂，其作用机制是由于D3T五元环内的二硫键可与Keap1的半胱氨酸残基中的巯基结合反应变化，进而改变Keap1蛋白上的半胱氨酸结构形态，破坏了Keap1和Nrf2的结合，促使Nrf2-Keap1二聚体解偶联，进一步激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路[29]。

二烯丙基硫化物是一种葱属蔬菜中常见的有机硫化合物，有抗癌和抗氧化的作用。近年来对亲脂性硫醚的研究发现，二烯丙基硫化物可激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路中解毒酶表达，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)，上述激活信号通路的强度顺序为DATS>DADS>DAS。然而，人们对于这些二烯丙基硫化物抗氧化的机制尚未明确，有待进一步研究。

3.3 含硒化合物

3.3.1 无机硒化合物 无机硒化合物是含硒的抗氧化剂，其中亚硒酸钠最为常见，但其尚有一些弊端，如一定的过氧化性，安全范围小、生物利用率低，未吸收的硒易导致土壤和环境污染，这让人们对于含硒抗氧化剂的研究逐渐转向了有机硒源的抗氧化剂。

3.3.2 有机硒化合物 依布硒啉是一种新型抗炎药物，是化学合成的有机硒化合物。依布硒啉可调节Keap1-Nrf2/ARE信号通路下游的解毒酶基因的表达，发挥细胞保护作用，可作为一种高效的抗氧化剂和抗炎剂[30]。SFN-isoSe是萝卜硫素的硒异位体化合物，比SFN的抗氧化作用更强。同时有机硒化合物3selena-1-dethiacephem已被证实是一种ROS的清除剂和Keap1-Nrf2/ARE信号通路的激活剂。硒代蛋氨酸(SeMet)已被证实可在饲料中添加提高动物的抗氧化能力。SeMet通过向身体蛋白中非特异地掺入硒蛋氨酸形成内源硒储备；在氧化刺激下，储备的硒可形成硒蛋白，发挥抗氧化的作用。研究发现，富硒益生菌、富硒酵母可显著提高奶牛Keap1-Nrf2/ARE信号通路下游抗氧化酶GSH-Px的活性，提高机体的抗氧化能力[31]。

3.3.3 硒多糖 采用热水浸提法从新鲜的平菇子中提取触动富硒平菇多糖，与平菇多糖比较发现富硒平菇多糖可更好的清除如羟基、ATBS、DPPH等ROS自由基，抑制由过氧化氢(H2O2)诱导小鼠心肌细胞的氧化损伤，说明富硒平菇多糖在体外具有较强的抗氧化能力[32]。此外，从富硒灰树花子实体中提取粗硒多糖(Se-GFP)，并进一步分离纯化出一种新型硒多糖-杂多糖Se-GFP-22。在对Se-GFP-22与不含硒的GFP-22比较中发现Se-GFP-22具有更强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力[33]。

3.3.4 硒纳米颗粒 除了无机硒、有机硒源和天然硒多糖外，硒纳米颗粒(SeNPs)与无机硒和有机硒比较，具有独特的物理化学性质和生物活性。有研究建立一种干酪乳杆菌生物合成SeNPs的生物技术，用该方法合成的SeNPs不仅可以减轻敌草枯或羟基对肠上皮细胞的氧化应激损伤，提高GSH-PX活性，发挥抗氧化剂的作用，而且在硒的细胞毒性方面显著低于亚硒酸钠和SeMet和硒多糖[34]。除此之外，在壳聚糖(CTS)水溶液中合成SeNPs，通过喷雾干燥将SeNPs包埋到CTS微球中，从而形成载硒壳聚糖微球(SeNPs-M)，SeNPs-M不仅有较强的抗氧化活性，且细胞毒性显著低于SeMet[35]。SeNPs作为一种特殊形式的硒补充剂，因其良好的抗氧化性和独特的生物安全性受到世界各国的广泛关注。

3.4 重金属

微量的重金属是动物生存的必备品，但是过量的重金属可以对动物造成巨大的危害。有研究发现部分重金属可以通过Keap1-Nrf2/ARE信号通路激活ARE的表达。镉可以诱导ARE基因表达，抗镉诱导的氧化应激。金诺芬是一种抗风湿药物，它不仅含有重金属成分金，同时也通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，发挥药物抗炎作用。

除上述的4类抗氧化剂之外，过氧化氢类和多烯类的抗氧化剂也有被发现。对Keap1-Nrf2/ARE信号通路的作用大致分为两种，一种是Keap1-Nrf2/ARE信号通路的激活剂，激活信号通路加强下游调控的抗氧化酶的活性；另一种是刺激Keap1-Nrf2/ARE信号通路发生作用的ROS和自由基的清洁剂，可以清除引起氧化应激的ROS和自由基等。

4 展望

Keap1-Nrf2/ARE信号通路是预防癌症和其他慢性疾病(心血管疾病、神经退行性疾病和肺损伤)的重要靶点。当RNS或ROS等刺激细胞产生氧化应激反应时，会激活该信号通路负性调节Keap1蛋白使其与Nrf2解偶联，Nrf2进入细胞核与ARE识别并结合发挥抗氧化作用。Keap1-Nrf2/ARE信号通路可作为一个有效的药物作用靶点，进行药物研究试验，为预防和医治氧化应激相关疾病(如炎症、癌症、病毒病等)提供新的治疗药物以及治疗方案，该通路有十分广泛的研究潜力以及发展前景。因此，针对Keap1-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化剂的研究已成为了十分重要的研究领域。

与Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关的抗氧化剂的研究中，有一部分已经进入了临床试验阶段，已知的含硒化合物依布硒啉、萝卜硫素以及天然植物多酚中的白藜芦醇均已经参与了许多疾病的临床试验，比如慢性肾脏病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌等。在已知与Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关的抗氧化剂均为有亲电性的Keap1抑制剂，可通过修饰和改变Keap1上的半胱氨酸巯基，激活Nrf2/ARE系统，发挥抗氧化的目的。所以，Keap1与Nrf2连接处的半胱氨酸巯基可作为Keap1-Nrf2/ARE信号通路抗氧化剂的分子作用靶点，通过针对这个靶点深入研究，发现更多的抗氧化剂，为该信号通路的抗氧化剂研发提供了十分重要的研究方向。

过度的激活Nrf2/ARE也会诱导动脉硬化和癌症等疾病的发生，并且Keap1-Nrf2/ARE信号通路的对于氧化应激的抵御作用尚存在未知问题，还需进一步探索。此外，清除ROS和自由基也是抗氧化剂的作用机制之一。在含硒化合物的抗氧化剂中，不仅有通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路发生抗氧化功能的抗氧化剂，也有清除ROS和自由基而发挥抗氧化功能的抗氧化剂(亚硒酸钠、硒多糖、SeMet等)。抗氧化剂聚焦于硒纳米颗粒，其抗氧化性更强且生物利用率高，可作为抗氧化剂用于临床研究。今后在Keap1-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化剂的开发过程中，从含硒化合物中研发出具有高抗氧化活性和高生物安全性的抗氧化剂有巨大的潜力，如何能同时提高抗氧化活性和生物安全性是未来研制新型抗氧化剂的重点。