Bcl-2、Bax、Fas 在大肠癌脾胃虚弱证病人舌苔脱落细胞表达及其相关性研究

海 日，师建平，赵 敏，张 锁，荣宝山，党 赢，焦雨琦，李月炜，包领芝

（内蒙古医科大学中医学院，内蒙古 呼和浩特 010059）

大肠癌，是消化道常见恶性肿瘤。流行病学调查显示，其发病率依性别差异，位列世界恶性肿瘤谱的2、3 位[1]（女性男性分别排2、3 位）。近年癌证与舌苔脱落细胞相关的理化性质、蛋白表达、基因检测等研究屡见不鲜。中医舌象之所以与现代医学所研究的舌苔脱落细胞相关，是因为正常的薄润舌苔，在细胞层面上，由及时脱落的舌角化层细胞堆积而成。形成舌苔的过程，涉及细胞的凋亡，即形成了舌苔脱落细胞。舌苔脱落细胞，由鳞、柱状上皮细胞等舌上皮细胞，及红、白细胞等非上皮细胞组成。舌上皮细胞的正常细胞增殖过程及稳定的口腔pH 值，是正常薄白苔的关键。中医所讲的正常舌象是淡红舌，薄白苔。而舌象，直观的反映于舌质及舌苔，古人称其为脾胃的“探针”，故中医认为消化系统的疾病变化可经舌象体现出来。而众多现代医学研究者认为，若细胞增殖紊乱、代谢异常等细胞活性的改变可影响角化层细胞脱落延迟亦或使角化不全，细胞脱落受阻，细胞大量堆积于舌面，形成厚苔。

近年来，现代医学的研究者从血清肿瘤标志物、蛋白表达、基因等层面对大肠癌进行了研究，尽管研究如此多样化，但其与中医的研究缺乏关联性[2]。中医学者从病因病机方面对大肠癌进行了深入研究，认为该病病位虽在大肠，但随着病情进展，病邪可累及脾胃、肝、肾等脏腑。研究认为，大肠癌的主要病机是“脾虚”[3，4]，脾虚即后天之本失充，食物精微化生乏源，水谷精微不升反降，困为浊邪，下迫肠腑，加之正气不足，合而发病。故本课题选取则之“脾虚”的大肠癌脾胃虚弱证。以中医舌诊为立足点，借助现代实验方法，应用舌苔脱落细胞，对大肠癌脾胃虚弱证病人的舌苔脱落细胞进行研究，探索抑制凋亡蛋白Bcl-2、促进凋亡蛋白Bax、Fas 表达水平与大肠癌的关联性，为大肠癌的早期筛查提供参考，也为中医客观化研究提供实验支撑，进而更好地为临床服务。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017-03～2017-11 期间就诊于我校一附院的病人。其中大肠癌组最终入组的60例病人，经由结直肠癌术后，且无癌细胞转移的，中医辨证为大肠癌脾胃虚弱证的，年龄分布在40～73 岁区间，平均57.40 岁。非癌组的20 例，均为检查后排除大肠癌，经辨证为脾胃虚弱证的其他肠道疾病病人，年龄分布在26～70 岁区间，平均51.40 岁。选择同期来医院体检的健康人20 例，年龄分布在29～62岁区间，平均49.35 岁，记为正常对照组。各组年龄、性别构成比例无显著性差异。

1.2 主要试剂和仪器

Bcl-2 抗体（bs-0032R），Bax 抗体（bs-4564R），Fas抗体（bs-0215R），液基细胞保存液，95%乙醇，二甲苯，DAB显色试剂盒，SP试剂盒，液基细胞超薄制片机，光学显微镜等。

1.3 实验方法

用一次性压舌板，刮取舌中部舌苔，后存于液基细胞保存液中，再经制片，制得玻片标本。对标本采用免疫组化法处理，步骤简述如下：固定→水化→孵育→加A液→抗原修复→加B液→一抗孵育→加C液→加D液→显色→复染→脱水→封片→结果判定。其中，阴性对照组采用PBS 缓冲液代替一抗，其他步骤及方法不变[5]（见图4）。光镜下（400倍镜）观察Bcl-2、Bax、Fas三种蛋白的表达情况。

1.4 结果判定

在光镜下，Bcl-2、Bax、Fas蛋白的阳性表达为细胞浆和或细胞膜附着棕色或栗色，阴性表达为细胞浆和或细胞膜附着紫色。在参照Reimer[6]实验判断标准的基础上，将本实验的结果判定标准定为，Bcl-2、Bax、Fas 蛋白的阳性细胞数＞10%为阳性（+），≤10%为阴性（-）。注：每张玻片随机取5 个视野观察，综合判别。

1.5 统计学处理

采用Excel 整理数据，采用SPSS 20.0 进行统计分析和统计描述。计量资料的统计描述采用均数±标准差或中位数（四分位间距）表示。计数资料的统计描述采用率或构成比表示，多组间的比较采用行×列表卡方检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 三组间Bcl-2表达的比较

大肠癌组病人舌苔脱落细胞Bcl-2 蛋白的阳性表达显著高于其他两组，各组间Bcl-2 蛋白的表达有统计学差异（P＜0.05）（见表1）。

表1 三组间Bcl-2表达的比较

2.2 三组间Bax表达的比较

大肠癌组病人舌苔脱落细胞Bax蛋白的阳性表达显著低于其他两组，各组间Bax 蛋白的表达有统计学差异（析P＜0.05）。这可能是具同源性的，同属Bcl-2基因家族的，Bax蛋白和Bcl-2蛋白，效应相悖的表现（见表2）。

表2 三组间Bax表达的比较

2.3 三组间Fas表达的比较

大肠癌组、非癌组、正常对照组中，Fas 蛋白的阳性表达差异不大，尚不能认为各组间Fas 的表达有统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

表3 三组间Fas表达的比较

图1 Bcl-2阳性大肠癌组（×400）

图2 Bax阳性大肠癌组（×400）

图3 Fas阳性大肠癌组（×400）

图4 PBS免疫组化阴性对照（×400）

3 讨论

3.1 舌象特征

舌诊，是中医学的特色诊法之一，亦为中医诊断学的重要内容之一，传统医学认为，望舌即望舌质和望舌苔。从现代医学的解剖位置上讲，舌与胃肠相通，故胃肠疾患可以很好的反映于舌，舌象又通过司外揣内以探知胃肠的情况。故而，本课题研究发现，大肠癌组的舌象特征为淡白舌，腻苔。我认为形成此舌象的原因可能是本组病患脾胃两虚，后天之本失充，食物化生乏源，舌体缺乏充养，故舌色浅淡。又因病变本身的疫疠邪气凝集于肠腑，术后病人病灶已除，痰、火、瘀、毒等有形实邪不复，故舌色只比正常舌色浅淡。正如古人所讲：“脾胃为中土，邪入胃则生苔，如地上生草也”。腻苔，理论上讲为湿浊痰邪停聚、阳气被遏。本组病患脾胃虚弱，腻苔则可能由邪气阻滞肠腑，手术伤及阳气至其升散不及所致。

3.2 相关蛋白检测指标

研究结果显示，各组间Bcl-2 蛋白的表达有统计学差异。细胞凋亡是逐渐被人类认识到的，由多基因调控、多种酶介导的，不同于细胞坏死的一种细胞死亡。在大肠癌组，大肠癌病人舌苔脱落细胞的凋亡途径中，抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax结合，形成稳定的异二聚体，以抑制Bax 蛋白的活性。而在标本中，过量表达的Bcl-2蛋白，介导抑制细胞 DNA 的断裂[7，8]，以使凋亡受抑制，从而延长细胞的生命周期，保护细胞以达到永久存活的目的，故大肠癌组的Bcl-2 蛋白表达量较高（见图1）。有文献报道[9]，Bcl-2 蛋白的阳性表达率与癌症的转移、多药耐药及临床病例分期有关。

研究结果显示，各组间Bax 蛋白的表达有统计学差异。现代研究认为，Bax、Bcl-2 两种蛋白，通过拮抗作用对肿瘤的发生发展起重要作用，但与基因调控不同的是，Bax、Bcl-2 蛋白通过调控凋亡途径，以调节肿瘤细胞[10]，亦可维持正常细胞的周期。这两个凋亡调控蛋白通过线粒体途径发生作用，正常的健康细胞中Bax 蛋白以无生物活性形式存在，此时不能被Bcl-2抑制性结合。当细胞接收到凋亡信号，Bax蛋白释放一种物质，这种具有生物活性的物质，能通过改变线粒体外膜通透性，促进细胞凋亡的发生[11，12]。舌苔脱落细胞受到凋亡信号刺激后，Bax蛋白与高表达的Bcl-2蛋白结合，形成稳定的异二聚体，使得细胞凋亡被抑制，延长细胞生存期，细胞不能凋亡脱落。故Bax蛋白在大肠癌组病人舌苔脱落细胞中呈现低表达（见图2）。

实验所得大肠癌组病人的舌苔脱落细胞的Fas蛋白阳性表达（见图3），尚不能认为各组间Fas的表达有统计学差异。分析其原因：首先，参考的研究标本是归属组织学的大肠癌组织，本课题的研究标本则是归属细胞学的舌苔脱落细胞，这可能是形成Fas 表达差异的原因；其次，本课题研究范围小、样本少，可能是造成统计学差异的原因。Fas 蛋白在正常健康人的组织细胞中也有阳性表达，当阳性表达量的增加到一定程度时，Fas 系统开始诱导凋亡。研究显示[13]Fas 在大肠癌组织细胞中表达下调，这是由于肿瘤细胞的恶性增殖使细胞凋亡减少，基因调控抑制死亡受体的表达。

4 总结

综上，本文通过观察大肠癌脾胃虚弱证病人舌象特征及检测舌苔脱落细胞凋亡，发现大肠癌组的舌象特征为淡白舌、腻苔。在舌苔脱落细胞凋亡蛋白中，大肠癌组病人由于疾病病理病性等因素的影响，舌苔细胞凋亡受到抑制，使得Bcl-2 蛋白高表达，Bax 蛋白低表达。这种由于细胞凋亡与增殖失衡状态下一系列基因和多酶介导的细胞内环境变化而引发的恶变，可能是癌症发生发展的原因。本课题将中医舌诊与现代化的西医检测手段结合起来，为中医舌诊与大肠癌之间的关联性提供客观化实验依据。