急性脑梗死病人血清miR-23b、miR-34a 水平与颈总动脉内膜中层厚度相关性研究

李雨弥，唐 勇

（成都市第二人民医院急诊科，四川 成都 610011）

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是脑部供血动脉形成血栓、发生粥样硬化或异物流入颈动脉、脑动脉等引起脑部供血不足，进而引发脑组织坏死或软化的心血管疾病，其发病率、致死率极高，严重威胁病人生命安全[1]。ACI 发病除糖尿病、高血压、高血脂等传统因素外，表达失衡的微小RNA（microRNA，miRNA）是影响动脉粥样硬化、炎症反应的重要因素，miRNA可能在心脑血管疾病的发展进程中发挥重要作用[2]。miR-29b 是miRNA 其中一员，其在ACI 病人血清中表达下调，与促炎细胞因子水平有关，其有望成为ACI 诊治、预后评估的标志物[3]。微小RNA-23b（miRNA-23b，miR-23b）在脑外伤中表达异常，其可减轻脑水肿，抑制神经元凋亡，缓解长期神经功能缺失，miR-23b其可能是脑外伤的潜在治疗靶标[4]。微小RNA-34a（miRNA-34a，miR-34a）可调节血管内皮细胞凋亡，与脑水肿和动脉硬化、血管性痴呆等疾病有关，其可能成为缺血性血管损伤类疾病治疗靶标[5]。但miR-23b、miR-34a 在ACI 病人血清中的水平及与颈总动脉内膜中层厚度（intima-media thickness，IMT）的关系尚未有相关报道。基于此，本研究通过检测miR-23b、miR-34a 在ACI 病人血清中的表达水平、分析两者与IMT的关系，以期为早期防治ACI提供可靠凭据。

1 一般资料与方法

1.1 一般临床资料

选取2016-06～2019-01 于本院诊治的ACI 病人168 例进行研究（ACI 组），其中男88 例，女80 例；年龄37～79岁，平均年龄（59.64±5.80）岁；身体质量指数（body mass index，BMI）为18.94～26.02 kg/m2，平均 BMI 为（22.84±2.45）kg/m2。并以同时间段内于本院体检正常者172 例进行对照研究（对照组），其中 男 91 例 ，女 81 例 ；年 龄 39～78 岁 ，平 均年龄（58.95±5.71）岁；BMI 为 18.09～26.15 kg/m2，平均BMI为（22.63±2.38）kg/m2。两组性别、年龄、BMI等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。收集两组总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指标水平。

诊断标准：参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》ACI相关评判标准[6]。纳入标准：（1）符合ACI诊断标准；（2）所有病人均经MRI/头颅CT 影像学检查、确诊；（3）病人发病入院就诊时间≤72 h；（4）所有病人均首次发病；（5）生理病理检查资料齐全者。

排除标准：（1）合并短暂性脑出血、心肌梗死或其他心脑血管疾病者；（2）合并心、肝、肾并发症，严重感染者；（3）合并恶性肿瘤、手术诱发卒中者；（4）合并凝血功能障碍、痛风、自身免疫性疾病、精神障碍、恶性肿瘤者；（5）近期使用抗炎药物、抗血小板凝集、免疫抑制剂者。

所有病人家属签署知情同意书，且该项研究方法符合相关伦理学要求，经本院伦理委员会审核批准后施行本项研究。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol 试剂（货号：YDJ2531）购买于上海羽朵生物科技有限公司，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（货号：4366596）购买于上海睿铂赛生物科技有限公司，TaqMan®Universal PCR Master Mix（货号：AB-4324018）购买于上海嵘崴达实业有限公司；人血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：EK0537）购买于上海和序生物科技有限公司；人肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（货号：EH009）购买于上海吉泰依科赛生物科技有限公司。

Implen 超微量紫外分光光度计（型号：NP-80）购买于无锡莱弗思生物实验器材有限公司，ABI stepone plus 实时荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）仪（型号：美国ABI StepOne-Plus）购买于北京安麦格贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与预处理收集ACI 病人入院后次日和健康体检者体检当日空腹肘静脉血约5mL，静置35min，3500r/min 离心13min，分离得上层血清，分装并密封保存于20℃冰箱中，用于miR-23b、miR-34a、VCAM-1、TNF-α水平检测。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中 miR-23b、miR-34a表达水平从冰箱中取出冻存血清样本，无菌环境下冰上解冻，加适量TRIzol 裂解液，提取血清总RNA，具体操作流程参考TRIzol 试剂说明书。采用紫外分光光度计检测抽提RNA完整性、纯度及浓度。依照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 说明书操作，得 cDNA。按照 TaqMan®Universal PCR Master Mix 操作步骤将 cDNA 扩增，并进行 PCR 检测。miR-23b、miR-34a 均以U6 为内参，采用2-△△CT法计算miR-23b、miR-34a相对表达量（见表1）。

1.3.3 两组颈动脉IMT 检测采用彩色多普勒超声仪扫描双侧颈总、颈外及颈内动脉，测量IMT，所用探头频率为7.5MHz。

1.3.4 ELISA 法检测血清VCAM-1、TNF-α 水平 检测两组受试者血清VCAM-1、TNF-α 水平，检测步骤严格参照相应试剂盒说明书。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件分析所得实验数据。符合正态分布的计量数据以均数±标准差描述，比较两组间实验数据，进行双边t 检验；计数数据以“例”表示，行χ2检验；采用Pearson 法分析ACI病人血清miR-23b、miR-34a、IMT 水平与VCAM-1、TNF-α相关性及miR-23b、miR-34a与IMT水平的关系；采用Logistic回归分析ACI发生的影响因素。当P＜0.05时，表示数据间比较差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

与对照组相比，ACI 组病人总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高（P＜0.05），高密度脂蛋白降低（P＜0.05）（见表2）。

表2 两组一般资料比较(，n)

表2 两组一般资料比较(，n)

images/BZ_31_257_2454_470_2561.pngimages/BZ_31_470_2454_712_2561.pngimages/BZ_31_712_2454_963_2561.pngimages/BZ_31_963_2454_1086_2561.pngPimages/BZ_31_257_2621_470_2682.pngimages/BZ_31_963_2621_1086_2682.pngimages/BZ_31_470_2621_712_2682.png58.95±5.71 22.63±2.38images/BZ_31_712_2621_963_2682.pngimages/BZ_31_257_2742_470_2849.pngimages/BZ_31_470_2742_712_2849.pngimages/BZ_31_712_2742_963_2849.png年龄（岁）BMI（kg/m2）三酰甘油（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）59.64±5.80 22.84±2.45images/BZ_31_963_2742_1086_2849.png1.105 0.802 0.270 0.805 0.423 0.000 1.26±0.361.70±0.479.7050.000images/BZ_31_257_2955_470_3061.pngimages/BZ_31_470_2955_712_3061.pngimages/BZ_31_712_2955_963_3061.pngimages/BZ_31_963_2955_1086_3061.png0.000 1.29±0.370.94±0.299.6930.000

2.2 两组血清miR-23b、miR-34a表达水平及IMT水平比较

与对照组相比，ACI组病人血清miR-23b、miR-34a表达水平较高（P＜0.05），IMT增厚（P＜0.05）（见表3）。

2.3 两组血清VCAM-1、TNF-α水平比较

与对照组相比，ACI 组病人血清VCAM-1、TNF-α水平较高（P＜0.05）（见表4）。

表3 两组血清miR-23b、miR-34a表达水平及IMT水平比较()

表3 两组血清miR-23b、miR-34a表达水平及IMT水平比较()

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表4 两组血清VCAM-1、TNF-α水平比较()

表4 两组血清VCAM-1、TNF-α水平比较()

nimages/BZ_31_1275_2132_1488_2193.png组别对照组images/BZ_31_1488_2132_1617_2193.png172images/BZ_31_1617_2132_1915_2193.pngimages/BZ_31_1275_2254_1488_2315.pngt images/BZ_31_1488_2254_1617_2315.pngimages/BZ_31_1617_2254_1915_2315.pngVCAM-1（μg/L）235.02±54.28 13.954 TNF-α（ng/mL）18.46±4.31 49.78±9.25 40.167 0.000

2.4 ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a、IMT 水平与VCAM-1、TNF-α相关性分析

Pearson 法分析显示，ACI 病人血清 miR-23b 与VCAM-1、TNF-α 水平均呈正相关（r=0.345、0.459，P均＜0.05）；ACI 病人血清miR-34a 与VCAM-1、TNF-α 水平均呈正相关（r=0.437、0.456，P均＜0.05）；ACI病人IMT 水平与VCAM-1、TNF-α 均呈正相关（r=0.539、0.308，P均＜0.05）（见表5）。

2.5 ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a 水平与 IMT水平的关系

Pearson法相关性分析显示，ACI病人血清miR-23b、miR-34a表达水平与IMT均呈正相关（r=0.412、0.443，P均＜0.05）（见图1、2）。

表5 ACI病人血清miR-23b、miR-34a、IMT水平与VCAM-1、TNF-α的关系

图1 ACI病人血清miR-23b表达水平与IMT的相关性

图2 ACI病人血清miR-34a表达水平与IMT的相关性

2.6 影响ACI的Logistic回归分析

以总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α为自变量，以是否发生ACI 为因变量，行Logistic 回归分析，分析结果显示低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α 是影响ACI 发生的危险因素（P＜0.05）。

3 讨论

ACI是临床常见的脑部供血不足引发脑组织缺血、缺氧，从而出现脑组织神经功能缺失、坏死症状的脑功能障碍疾病，其发病急，可引起脑水肿，具有高危性，对病人生命安全构成直接威胁[7]。因此，必须寻找可早期评估、诊治ACI的有效指标，改善大脑供血状况，有效提高病人生存率和生活能力。

miRNA 广泛分布于人体各组织、器官和外周血中，在个体生长代谢、信号传导、炎症反应等生理病理过程发挥一定调节作用[8]。miRNA 参与脑水肿、脑外伤、动脉粥样硬化、心肌梗死、脑梗死等心脑血管类疾病的病理过程[9]。miR-181a-5p 在冠心病中表达异常，在血管炎症和动脉粥样硬化形成中起重要调节作用，可延缓动脉粥样硬化的进程，有望成为治疗动脉粥样硬化的新策略[10]。miR-499 在急性心肌梗死病人血浆中表达上调，其可作为治疗急性心肌梗死的潜在靶标[11]。miR-124 在ACI 病人血清中呈异常表达，动态监控miR-124 水平有助于防治缺血性中风[12]。以上研究证实，miRNA 表达失调与缺血性血管疾病的发病进展有关。miR-23b在心肌梗死病人血清中呈高表达，可促进心肌细胞凋亡，有望作为心肌梗死诊断的有效生物标志物[13]。miR-23b-3p是miR-23b其中一员，其在缺血性卒中病人血清中表达上调，可作为缺血性卒中预测、评估标志物[14]。本研究中miR-23b 在ACI 组病人血清中表达明显高于对照组，提示miR-23b 可能在ACI发生发展中起到重要作用。miR-34a具有生物学调节作用，其在心肌梗死中上调，与心肌梗死后的重塑及缺血后心肌纤维化相关，有可能成为治疗心肌梗死的靶标[15]。miR-34a-5p 是miR-34a 家族成员，在急性缺血性卒中病人中呈过表达，具有潜在调节作用，可作为卒中治疗靶点和预后评估指标。本研究中miR-34a在ACI组病人血清中的表达水平明显高于对照组，提示miR-34a 可能参与并影响ACI 疾病的发生发展过程。颈动脉IMT 水平升高是动脉粥样硬化内膜损伤评估的重要标志，其在ACI 病人中具有较高水平，与炎症因子TNF-α 呈正相关，TNF-α可作为ACI病人脑动脉狭窄的标记物和危险因素，且动态监控炎症因子及IMT 水平，有利于评估病情程度和预后。本研究显示ACI组病人IMT水平明显高于对照组，提示颈动脉IMT 可能在ACI 发病过程中发挥一定作用。

研究显示，VCAM-1、TNF-α 在ACI 病人中呈高水平，经醒神通腑方联合胞二磷胆碱注射液治疗后，两者水平显著降低，两者参与的炎症反应可进一步促进脑梗死的发生与发展。本研究中ACI组病人血清VCAM-1、TNF-α 水平明显高于对照组，提示 VCAM-1、TNF-α 可能在 ACI 疾病发展进程中起到一定作用。本研究显示，ACI 病人血清miR-23b、miR-34a、IMT 与 VCAM-1、TNF-α水平均呈正相关，提示miR-23b、miR-34a、IMT可能均与VCAM-1、TNF-α 相互作用共同影响ACI 发生与发展。进一步分析发现，ACI 病人血清miR-23b、miR-34a 表达水平与IMT 均呈正相关，提示miR-23b、miR-34a 可能与 IMT 相互影响，进而在 ACI 疾病发展中发挥重要作用。更进一步研究显示，低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α是影响ACI发生的危险因素，提示低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α 水平升高，均可能增加ACI 发病风险，及时动态监测低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α水平，有助于及早防治ACI。

综上所述，ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a 均表达上调，两者均与颈动脉IMT 关系密切，两者可能与颈动脉IMT 相互影响，共同参与ACI 发病进程。但本研究仍存在一些不足之处，即研究样本量较少，可能引起结果发生一定偏差，后续研究将进一步扩大样本量，进行更深入研究。