细胞间线粒体转移治疗缺血性脑卒中研究进展

苏晓梅，张丹参,2

（1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北 石家庄 050000；2.河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050000）

脑卒中是引发死亡和身体残疾的主要原因，缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）约占脑卒中发病率的80%。IS的主要治疗方法是通过溶栓或机械取栓实现快速再通。组织型纤溶酶原激活剂是1996年以来美国食品药品监督管理局唯一批准的治疗急性IS的有效药物，但由于治疗窗狭窄，应用受限［1］，且即使在有效时间内再通后，梗死面积也常由于缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤而继续增大［2］，开发新的治疗方法势在必行。

线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，是细胞内的能量工厂，可通过调节钙信号、细胞代谢和细胞凋亡维持细胞稳态。线粒体发生功能障碍后可参与脑缺血的发病机制，导致IS后神经元损伤和细胞死亡［3］，修复线粒体功能可阻断上述损伤过程。研究表明，在IS后，星形胶质细胞（astrocyte，AST）可感知应激，并将线粒体作为“help-me”信号转移到临近的损伤神经元中［4］。然而，细胞间释放和进入的潜在机制仍有待确定。将细胞间线粒体转移到受损细胞是治疗IS的新方法，可改善受损神经元的细胞生存状态、神经突再生以及其他功能特性［5］。其中，介导细胞间线粒体转移的方法包括形成细胞间隧道纳米管（tunneling nanotubes，TNT）或细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）、缝隙连接蛋白43（connexin-43，Cx43）、细胞融合和线粒体挤压等过程。本文综述了线粒体功能障碍在IS病理过程中的作用、介导细胞间线粒体转移的主要机制以及调控细胞间线粒体转移的关键蛋白，为线粒体功能障碍相关疾病的治疗提供新的潜在靶点和思路。

1 线粒体功能障碍在缺血性脑卒中发病中的作用

线粒体在细胞中发挥重要作用，包括产生ATP、维持氧化还原平衡和调节细胞凋亡等［6］。IS引起大脑氧和葡萄糖缺乏，触发一系列破坏神经元的细胞和分子过程，其中断会导致神经元线粒体稳态受损［7］。脑缺血首先诱导基质Ca2+超载，氧化应激升高，随后线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）开放［8］；MPTP的开放使线粒体通透性增加，允许溶质如水、大分子和离子自由进入线粒体基质，引起线粒体肿胀，外膜破裂，电子传递链受损，释放大量活性氧（reac⁃tive oxygen species，ROS）［9］；ROS的过量产生与神经元死亡密切相关，进而导致缺血后脑组织的功能和结构损伤［10］。此外，线粒体通透性升高也会促使膜电位降低，进一步加剧线粒体ATP水平降低和细胞内Ca2+浓度升高，加剧神经元损伤［11］。因此，改善线粒体功能可能是治疗IS的有效策略。

2 细胞间线粒体转移

线粒体是电子传递链消耗氧气并产生ATP的能量核心，为细胞和组织提供生命活动所必需的能量。长期以来的观点都认为线粒体终生保留在细胞内，是从母体遗传的［12］。但在某些情况下，线粒体可释放到细胞外，在细胞间进行转移［13］。多种细胞具有供出或接收其他细胞（包括淋巴、神经元或心肌细胞等）线粒体的能力［14］。细胞器交换是一种特殊的细胞间通讯形式，它允许单向或双向运输小分子或离子及细胞内结构，包括线粒体、溶酶体、内体小泡和质膜组件等［15］。研究表明，线粒体从一个细胞转移到另一细胞是一种保护机制，负责将受损细胞从线粒体功能障碍中拯救出来，以应对应激［16］。补充受体细胞中受损线粒体的方法很多，共孵育是最简单的方法，不同细胞系的转移效率不同；显微注射和其他侵入性技术如纳米刀也可向人体细胞注射线粒体并快速替换其内源性的固有线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），但其效率比共孵育方法低［17］。为促进线粒体内化进入受体细胞，其他技术也已开发出来，如将线粒体与细胞穿透肽Pep-1结合，用线粒体外膜转位酶磁珠标记线粒体，以及通过MitoCeption技术增加线粒体摄取等［18-20］。

通过内源性或外源性线粒体转移可维持受损细胞中的线粒体功能，这在帕金森病、脊髓损伤和脑卒中模型中得到证实，强调了线粒体转移治疗在中枢神经系统损伤后功能恢复中的有效性［21］。线粒体转移提供了一种有利于脑卒中后神经元存活和再生的治疗新模式。由于线粒体内化进入病变组织的有效性取决于线粒体细胞器的数量、质量及其合适的输运方式，因此线粒体治疗的疗效在患者之间可能存在差异。如将线粒体转移应用于临床，需要更好地了解线粒体传递和细胞摄取的机制。

在神经元中，线粒体集中于突触前神经末梢，转运到胞体距离较远，因而缺血后胞体自身的线粒体不能迅速得到补充。可见，神经元正常功能的发挥对线粒体尤为依赖，细胞外线粒体转移为保护神经元开辟了一条新途径。神经元中存在一系列与线粒体相关的调控信号，在它们的调控下，线粒体通过适时适度的动力学变化以响应神经元在不同时期和不同区域的能量需求，影响神经元的存活［22］。Huang等［23］通过原位注射或系统给药转移外源性线粒体，用溴尿苷（BrdU）预先标记线粒体追踪其分布，发现其被神经元、AST和小胶质细胞摄取，如阻断供体线粒体的电子传递，其对神经元的保护作用明显减弱。在体实验中，原位注射线粒体可减轻大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery oc⁃clusion，MCAO）模型中大鼠的脑梗死体积，并改善其运动功能。此外，若通过侧脑室注射肌肉来源的自体线粒体，可减弱细胞氧化应激和凋亡，减轻反应性AST增生，促进神经发生，逆转IS后的神经功能损伤［24］，表明外源性线粒体转移是保护损伤神经元的有效措施。

2.1 AST线粒体转移治疗缺血性脑卒中损伤的神经元

在中枢神经系统中，AST与神经元之间存在广泛而复杂的信息传递，以直接、相互作用的方式与神经元发生联系，在神经系统的发育、突触传递、调控信息处理与信号传递、离子平衡、调节神经和突触的可塑性等方面均发挥重要作用［25］。Hayakawa等［4］报道，AST可直接为神经元提供功能性线粒体，将神经元从缺血性损伤中拯救出来，表明线粒体的动态转移过程并不局限于细胞内，而是包含了细胞间相互作用，该作用体现在以下2方面：①在细胞水平上的氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）模型中，用荧光染料MitoTracker Red CMXRos荧光标记AST培养液（astrocyte-conditioned medium，ACM）中的线粒体，再将ACM与损伤后的神经元共孵育后，即可在神经元内检测到AST线粒体，表明AST可将健康线粒体转移给邻近神经元，使损伤后的神经元ATP水平得以恢复，细胞存活率及细胞可塑性增强；但若从ACM中去除细胞外线粒体，则该神经保护作用消失。②在MCAO动物模型造模3 d后，在梗死区周围皮质直接注射来源于AST的线粒体，可在神经元中发现该线粒体，并可通过增加磷酸化蛋白激酶B和Bcl-xL的水平而增加神经元的存活率。上述结果表明，AST可以通过转移正常线粒体来拯救脑卒中后受损的神经元。此外，神经元还可释放受损线粒体并将其转移至AST，进行处置和再循环［26］。

2.2 干细胞作为线粒体供体治疗缺血性脑卒中

线粒体从AST向损伤神经元的内源性转移是短暂的，不足以产生强而稳定的神经保护作用，如无外源性治疗干预，AST的线粒体转移不能终止脑卒中引发的继发性细胞死亡。因此，利用干细胞治疗线粒体功能障碍相关疾病，在脑卒中研究领域引起了极大的兴趣，以干细胞为基础的线粒体转移是提供正常线粒体的有效方法［27］。多项研究将干细胞作为线粒体供体，将线粒体从人干细胞转移到线粒体受损的细胞，可恢复无功能线粒体的哺乳动物细胞的有氧呼吸［28］。在MCAO模型大鼠中，给予间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），使线粒体从MSC转移至损伤神经元，减少脑梗体积，改善神经学指标［31］。此外，在鱼藤酮诱导的体外帕金森病模型中，多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）衍生的AST可自发将功能性线粒体释放到培养基中，显著逆转鱼藤酮诱导多巴胺能神经元退行性病变和轴突缩短，表明iPSC衍生的AST可作为损伤多巴胺能神经元的线粒体供体，减弱其病理反应，挽救多巴胺能神经元变性［32］。因此，可利用干细胞作为线粒体供体进行线粒体转移，以治疗脑卒中或其他线粒体功能障碍疾病。

3 介导细胞间线粒体转移的主要机制

多种信号分子可参与细胞间线粒体转移，影响细胞间线粒体转移的机制包括形成TNT、EV、Cx43、细胞融合以及线粒体挤压等过程。TNT和Cx43通过膜管结构维持2个连接细胞之间进行通信，而EV则允许2个分离细胞之间进行信息传递，确保长距离通讯［33］。事实上，细胞间线粒体转移提供了一种细胞间信号传递的新模式，它可在体内发生，并在各种病理条件下发挥作用，恢复受损细胞功能［34］。因此，靶向线粒体转移有望成为治疗线粒体功能障碍疾病的新方法。

3.1 隧道纳米管

在体外和体内实验中，不同类型细胞间都会形成TNT，其可促进细胞器、膜囊泡、小分子可溶性细胞质和膜分子的选择性交换。建立纳米管首先要形成一个类似于伪足状的膜突起，在到达受体细胞后收缩，留一个与底物分离的超细结构，TNT对于有效的线粒体转移至关重要，若用化学抑制剂或机械应激抑制TNT的形成则可减少线粒体交换［35］。线粒体通过TNT的转移通常是单向的，从启动TNT形成的细胞到受体细胞［36］。然而，也有少数双向转移的报道［37］。

线粒体损伤是基于TNT线粒体转移的主要触发因素。线粒体功能完全缺失后（包括mtDNA损耗或加入线粒体抑制剂），激活线粒体转移。在I/R损伤中，MSC通过TNT样结构将线粒体转移至损伤内皮细胞，并通过抢救有氧呼吸抑制内皮细胞凋亡［38］；同样，MSC可通过TNT结构将线粒体转移至I/R损伤后的心肌细胞，改善细胞存活率［39］。而在大肠杆菌性肺炎模型中，线粒体通过TNT在MSC和先天免疫细胞之间进行转移，可增强肺泡巨噬细胞吞噬入侵细菌的能力［40］。其他有利于TNT形成的条件是血清饥饿或过氧化氢诱导及刺激海马AST和神经元中P53和纳米管的形成［41］。同样，高血糖或酸化的培养基以及刺激上皮细胞间充质转化的细胞因子，会通过TNT的形成增加线粒体转移［42］。

3.2 细胞外囊泡

几乎每种细胞均可在细胞外培养基中分泌不同类型的囊泡，大小在40～1000 nm之间，称为EV。EV是由细胞脱落的含有膜的囊泡，包含蛋白质、脂类和核苷酸，在细胞间通讯中发挥重要作用。根据起源、大小和分子组成，EV可分为微泡、外泌体和凋亡小体。EV是细胞间通讯的工具，存在于许多生理和病理过程，可作为健康和疾病的生物标志物［43］。不同EV中装载的线粒体蛋白和mtDNA虽尚不清楚，但已在其中检测到线粒体成分。较大的EV可包含完整的线粒体颗粒和mtDNA，这在MSC中可见，并参与其细胞间线粒体转移。研究发现，MSC可脱落EV，包括外泌体（直径50～100 nm）和微囊泡（直径0.1～1 mm），进入细胞外空间，进行线粒体吞噬和运送微RNA（microRNA，miRNA）［44］。此外，在AST中也出现EV，从AST释放的EV含有线粒体，可在OGD或IS时转运至损伤神经元，发挥神经保护作用［4］。迄今，游离mtDNA跨线粒体内膜和外膜的细胞间转移机制仍不清楚，而在细胞间线粒体转移过程中，最可能通过EV介导整个线粒体颗粒进行转移，恢复线粒体功能。

3.3 细胞融合

细胞融合是2个独立细胞通过融合细胞膜共享细胞器和胞质化合物的过程。永久性细胞融合使得细胞共享细胞质并具有独特核型，而部分细胞融合则允许短暂而直接的细胞间通讯，并交换多种蛋白质复合物和细胞器（包括线粒体）。据报道，成熟干细胞和胚胎干细胞可与心肌细胞、肝细胞和神经元融合，有助于细胞的分化和可塑性维持［45］。损伤和炎症可促进靶器官的细胞融合，髓细胞和淋巴细胞在损伤或炎症反应时可与不同组织融合［46］；采用干细胞治疗心肌梗死时，干细胞与心肌细胞之间可发生部分或整体的细胞融合，恢复线粒体功能并促进心肌细胞再生［47］。Acquistapace等［48］将人脂肪干细胞与小鼠心肌细胞共培养，发现细胞间形成F肌动蛋白连接，表明线粒体可通过部分细胞融合参与细胞功能恢复过程［49］。将MSC与线粒体疾病患者的皮肤成纤维细胞共培养，观察到皮肤成纤维细胞异常的线粒体形态从裂变状态被拯救到融合状态，线粒体功能恢复［50］。

3.4 缝隙连接蛋白43

连接蛋白在低聚化后形成缝隙连接，允许细胞连接和转移小分子细胞成分，其中Cx43在调节细胞间线粒体转移过程中发挥重要作用，其以Ca2+依赖的方式，通过形成TNT和EV调控细胞间线粒体从MSC转移到脂多糖损伤的肺泡上皮细胞，恢复肺泡生物能，从而保护急性肺损伤［51］。此外，缝隙连接可介导线粒体微粒与质膜连接，形成通道，小分子物质可通过由Cx43组成的连接蛋白半通道，扩散进入受损的神经元［52］。

3.5 线粒体挤压

线粒体挤压是线粒体转移的另一种机制，在特定条件下细胞中可释放线粒体或线粒体成分。如在ROS大量产生的情况下，HeLa细胞可挤压释放出线粒体碎片［53］。线粒体挤压不仅在体外发生，在体内也可发生，如血小板挤压包裹于微粒和游离细胞器中的功能性线粒体，以此增强炎症反应［54］。此外，用抗FAST抗体处理小鼠肝细胞，在窦周间隙和血清中检测到线粒体，表明发生线粒体挤压［55］。

4 调控细胞间线粒体转移的潜在靶蛋白

细胞应激是诱导细胞器转移的必要条件，因为当线粒体功能相对完善时，线粒体转移很少发生，而在线粒体功能几乎完全缺失（如mtDNA缺失或使用线粒体抑制剂处理的情况下）才会触发线粒体转移［56-57］。线粒体转移是受损细胞应激的后续反应，旨在推动体内组织修复，改善细胞功能［58］。此外，启动细胞间功能线粒体转移与细胞损伤程度有关，细胞内具有触发线粒体转移的机制，以响应来自受体细胞的损伤信号，明确调控线粒体转移的潜在靶点将有助于阐明线粒体转移机制，用于线粒体恢复治疗。

4.1 线粒体损伤相关分子（damage⁃associated molecules，DAM）

理论上，细胞接收到来自受体细胞的环境信号，可导致受体细胞中功能障碍线粒体的氧化应激，触发线粒体转移。在细胞应激时，细胞内释放DAM（包括受损的线粒体、mtDNA和受损细胞释放的线粒体产物）到细胞外作为机体的应激信号［59-60］。Mahrouf-Yorgov等［61］发现，细胞在应激时发生线粒体功能障碍，并释放mtDNA；当MSC与受到过氧化氢刺激的心肌细胞或内皮细胞共培养时，MSC吞噬并降解mtDNA，刺激线粒体产生能量，促进MSC的线粒体转移。此外，细胞在氧化应激和炎症状态下也会释放ROS，触发线粒体转移，促进受损细胞和MSC之间的交互作用；ROS清除剂则可阻断损伤细胞释放mtDNA。

4.2 线粒体Rho GTP酶1（mitochondrial Rho GTPase1，Miro1）

Miro1是线粒体外膜上与微管中线粒体运动相关的钙敏感衔接蛋白，与驱动蛋白/动力蛋白适配器蛋白结合，促进线粒体通过TNT在2个细胞之间进行迁移。此外，通过调节细胞骨架运动蛋白可控制线粒体的运动速度，在TNT依赖性细胞间线粒体转移中发挥重要作用［62］。研究表明，Miro1可参与TNT介导的线粒体转移［63］，促进AST的线粒体转移到神经元中［64］。在MSC和肺泡上皮细胞共培养系统中，Miro1的过表达可促进线粒体从MSC转移到上皮细胞，增强了MSC对上皮细胞的修复能力。此外，ROS的产生可通过Miro1影响线粒体运动［65］。过表达的Miro1也可相应提高与ROS水平升高相关的缺血损伤后的神经恢复作用［66］。在人急性髓系白血病中，ROS驱动TNT形成，并通过NADPH氧化酶-2调控线粒体从骨髓基质细胞转移到白血病母细胞中［67］；在蒽环类药物诱导的心肌病过程中，iPSC中Miro1的表达高于MSC，使得线粒体转移更高效。相反，用RNA干扰技术敲除Miro1，则线粒体的转移效率降低。上述研究提示，Miro1在线粒体转移过程中发挥重要作用。

4.3 CD38

除来自受损细胞的信号外，细胞的内在信号也有助于线粒体转移。据报道，CD38可催化线粒体膜中环状ADP核糖（cyclic ADP ribose，cADPR）的合成，从而调动Ca2+来触发多种细胞反应［68］，如在AST中，CD38催化NAD+转化为cADPR，随后CD38将其泵入细胞质基质，产生细胞内游离Ca2+。当皮质或海马AST与神经元共培养时，无论是在质膜上还是在细胞内，AST细胞中的CD38均显著过表达。经研究证实，神经元释放的谷氨酸可诱导AST中CD38过表达，进一步增加了AST和神经元之间双向通讯的复杂性［69］。研究表明，CD38-cADPR信号可介导线粒体在不同细胞间转移，如线粒体从骨髓基质细胞转移到多发性骨髓瘤细胞［70］以及调控AST与神经元之间的双向线粒体转移［71］。IS后，线粒体从AST向神经细胞的转移就是由CD38-cADPRCa2+信号通路介导的，通过CD38 siRNA抑制CD38信号可减少AST胞外线粒体转移；若激活AST的CD38信号，则可促进线粒体从AST释放［4］。此外，从正常人AST中分离出线粒体，立即与饥饿的人胶质瘤细胞（U87）共孵育，线粒体可从正常人AST转移到U87细胞，该内吞作用是由NAD+-CD38-cADPRCa2+信号通路介导的，可挽救有氧呼吸，增强胶质瘤的体内外放射敏感性［72］。研究发现，CD38是通过内源性维A酸或外源性维A酸的代谢调节物调节的，AST中CD38的调控对围产期低氧缺血性脑损伤具有神经保护作用［73］。此外，CD38可驱动AST线粒体转移介导Sigma-1受体激活而发挥抗抑郁类作用［74］。上述结果表明，正常细胞可检测到邻近应激细胞一定程度的代谢紊乱，帮助恢复其功能，从而阻止细胞凋亡的启动［75］。

4.4 肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）

应激细胞或濒死细胞会释放线粒体，作为危险警告信号。当受到TNF-α刺激时，小鼠胚胎成纤维细胞和肝细胞通过自身溶酶体外泌作用排出线粒体［55］。在人T淋巴母细胞白血病细胞和小鼠成纤维细胞中，TNF-α诱导坏死，并伴随着线粒体的胞外释放。这是一个激活过程，发生在细胞膜破裂之前，线粒体是完整的，并无mtDNA释放［60］。早期研究表明，TNF-α诱导蛋白2可诱导TNT膜突起形成，上调TNF-α/NF-κB/TNF-α诱导蛋白2信号通路，进一步促进TNT的形成［76］。此外，TNF-α可通过上调谷氨酰胺酶的表达促进AST中EV的释放，用TNF-α处理小鼠AST后，EV释放增加并伴随谷氨酰胺酶蛋白水平上调，且TNF-α介导的EV释放增加可被谷氨酰胺酶抑制剂阻断，表明谷氨酰胺酶是控制AST神经炎症过程中EV释放的重要调节因子［77］。

5 结语

线粒体功能障碍是IS病理过程中的早期事件，损伤后的线粒体通过增加ROS形成、钙积累、诱导MPTP开放、控制炎症和凋亡、激活NLRP3炎症小体等方式参与细胞死亡过程［78］。近年来，线粒体转移的研究为细胞间通讯开辟了一个全新的视角。研究发现，线粒体本身可作为“help-me”信号，响应多种细胞外刺激，并招募相邻细胞的线粒体来拯救受损细胞，特别是在中枢神经系统中，线粒体集中于神经元的轴突末端和树突状突起。因此，转移外源性的正常线粒体成为治疗损伤神经元的有效方法，开启逆转人类疾病中线粒体功能的新时代。线粒体转移虽已成功应用于心肌I/R损伤的儿科患者［79］，但在临床上广泛、安全地实施线粒体转移仍面临多种挑战。首先，病理状态下线粒体转移在体内、体外都可发生，然而，线粒体是否可在生理条件下进行细胞间移动，以及这种转移的确切作用仍然未知。其次，干细胞可能是重要的细胞器供体，因此，成体干细胞、间充质基质细胞、成纤维细胞和造血干细胞有望成为潜在的线粒体供体，未来针对干细胞动力学调控机制的研究是治疗线粒体疾病的重点之一。此外，阐明线粒体转移的生理意义需要开发新的荧光和基因线粒体跟踪工具，然而利用荧光染料来追踪线粒体转移，会产生染料泄漏的可能，使得细胞间线粒体转移可视化成为难点。最后，线粒体从供体细胞释放和被受体细胞识别的机制尚不明确，阐明细胞间线粒体转移机制可为线粒体功能障碍相关疾病的治疗提供新的潜在靶点和思路。