环二鸟苷酸在生物膜形成中作用的研究进展

冯 媛， 王 惠， 王崇刚

作者单位： 山西医科大学第二附属医院感染性疾病科，太原030001。

耐药细菌的不断出现和传播严重威胁人类健康[1]。生物膜是导致耐药的一种重要机制，并且多数细菌感染与之相关。生物膜通过一系列不同的机制，使生物膜内的细菌对抗生素和消毒剂的抵抗能力显著高于浮游菌，如生物膜基质对抗生素的抗渗性、生物膜核心部位细菌的生长速率降低、存在耐受抗生素的持留菌和生物膜内细菌外排泵过表达，并引起持续感染，是治疗失败的主要原因[2]。临床观察和实验研究表明，大多数情况下，仅抗生素治疗不足以根除生物膜感染[3]，因此抑制生物膜形成的药物将是目前临床治疗中的重要补充[4]。环二鸟苷酸[Bis-（3'， 5'） cyclic diguanylic acid, c-di-GMP]是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使，在协调细菌生长和行为各个方面均有重要作用，包括运动、毒力、生物膜形成和细胞周期等[5]。干扰和调节c-di-GMP可能是控制生物膜形成的重要措施。本综述对c-di-GMP结构、功能、调节，在生物膜形成中的作用及相关治疗作介绍。

1 c-di-GMP结构、调节、功能

c-di-GMP是环二核苷酸 （CDN）中最早被发现、研究最多、作用广泛且普遍存在的细胞内信号分子[5]。最初在木糖葡糖杆菌中作为纤维素合成酶的变构激活剂被人类发现并定义[6]，随后在大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等细菌中均有发现。c-di-GMP单体具有两重对称性，两个GMP基团由一个5'，3'大环融合而成。c-di-GMP介导的信号转导系统包括四部分，即合成c-di-GMP的二鸟苷酸环化酶（DGC）、降解c-di-GMP的磷酸二酯酶（PDE）、c-di-GMP效应分子及受效应分子直接调控的下游靶标[7]。细菌内存在与c-di-GMP代谢酶结构类似并且具有感受结构域的分子，可以感知细菌内外信号，调节c-di-GMP代谢酶活性，进而影响c-di-GMP水平。不同水平c-di-GMP通过介导其效应分子及下游靶标发挥作用，参与细菌多种生理功能。目前已经被鉴定的c-di-GMP效应分子有mRNA核糖开关、转录调节因子、含有PilZ结构域的蛋白质、以及含有退化的GGDEF和EAL结构域的蛋白质。

细菌内c-di-GMP水平受到DGC和PDE严格调控，并且这种调控既有全局层面又有局部层面[7]。一般来说，低/高水平c-di-GMP分别与细菌的运动和生物膜形成相关。c-di-GMP由DGC催化2分子GTP缩合形成，并通过PDE水解为2分子GMP或线性pGpG。PDE含有EAL或HD-GYP结构域，而大部分DGC具有GGDEF结构域，该结构域上存在DGC的催化活性位点（A-site）和变构结合位点（I-site）。当c-di-GMP以二聚体形式与I位点结合，DGC的活性受到产物非竞争性抑制，这有助于维持c-di-GMP水平的稳定[8]。

生物膜形成是细菌感染迁延不愈的主要原因。体外研究表明外源性c-di-GMP可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，但无明显抗微生物活性。然而Brouillette等[9]却发现c-di-GMP在体内具有抗微生物活性，可以减少小鼠乳腺炎模型中金黄色葡萄球菌的定植，并呈剂量依赖性，200 nmoL c-di-GMP基本可以清除乳腺中的金黄色葡萄球菌[乳腺组织中菌落形成单位（CFU）减少为原来的万分之一，P＜0.001]。c-di-GMP具有抗微生物活性可能是其在体内引起宿主免疫应答的结果，Karaolis等[10]的研究为此提供了依据，他们提出c-di-GMP是一种免疫刺激分子，可以触发固有和适应性免疫应答。与之前实验不同，该研究通过用c-di-GMP对小鼠乳腺预处理（细菌接种前12 h和6 h），发现对金黄色葡萄球菌感染有显著的保护和预防作用（乳腺组织中CFU减少为原来的万分之一，P＜0.001），认为该保护作用可能是c-di-GMP触发固有免疫应答的结果。随后进一步研究了c-di-GMP对宿主免疫应答的影响，基于以下发现，提出c-di-GMP可以触发Th1细胞免疫应答：c-di-GMP可以激活人树突细胞的p38MAPK信号通路，诱导树突细胞的成熟（表达成熟标志物、招募效应细胞、刺激T细胞增殖）；另外c-di-GMP还具有佐剂潜力，可以显著提高抗体滴度，以IgG2a为主，并在小鼠细菌性肺炎模型再次证明c-di-GMP可以触发固有免疫应答[11]。Zhao等[12]进一步发现c-di-GMP预处理也可以减少鲍曼不动杆菌在小鼠模型的肺部定植，并且是通过诱导MCP-1等趋化因子，招募嗜中性粒细胞介导的。目前对c-di-GMP调控免疫的研究十分有限，但c-di-GMP的免疫调控功能将有望在对抗细菌感染方面发挥重要作用。

2 c-di-GMP在生物膜形成各阶段的作用

典型的生物膜形成周期包括四部分：①细菌附着在生物或非生物表面上；②细菌失去运动能力，开始产生生物膜基质，形成生物膜；③生物膜成熟和增厚；④生物膜扩散（随着生物膜的老化，细菌从生物膜中扩散，恢复到浮游状态，生命周期重新开始）。生物膜的形成存在多种调节机制，其中c-di-GMP在生物膜的形成和细菌运动中起着至关重要的作用，一直是研究关注的焦点。生物膜的形成过程包括表面附着、运动控制[游泳（swimming）、群集运动（swarming）、颤动（twiching）]、生物膜基质的产生、生物膜扩散，这些都与c-di-GMP水平有关[13]。

2.1 附着与运动

细菌在表面的初始可逆附着需要依靠不同运动方式来实现。细菌在水溶性/半固体/非生物表面的运动方式分别是游泳、群集、颤动。鞭毛和菌毛是介导这三种运动方式的细胞器，它们的合成、组装及功能均受到c-di-GMP高度调节。转录因子FleQ是一种细菌AAA+ATP酶增强结合蛋白，是铜绿假单胞菌鞭毛基因的主要激活因子，当c-di-GMP高水平时，c-di-GMP与ATP竞争结合FleQ使其ATP酶活性降低，抑制鞭毛基因转录[14]。Trampari等[15]发现c-di-GMP可以调控鞭毛的输出，鞭毛的输出装置由6个膜蛋白和3个可溶性蛋白FliI与FliH和FliJ构成，其中FliI ATP酶活性对鞭毛输出装置的启动有重要作用，而c-di-GMP与FliI结合进而抑制鞭毛的输出。c-di-GMP通过对细菌运动功能调控进而介导表面黏附及生物膜扩散。例如，大肠埃希菌和肠血清型伤寒沙门菌，c-di-GMP通过效应分子YcgR（PilZ结构域的蛋白质）调控游泳运动。高水平c-di-GMP与YcgR结合，并以结合形式与鞭毛马达定子MotA相互作用，影响马达运转及能量产生，进而抑制游泳运动，而细菌内PdeH（PDE）可以水解c-di-GMP，使其处于低水平来维持游泳运动[16]。类似的机制在枯草芽孢杆菌也存在[17]。群集运动是由鞭毛和菌毛共同介导的，YcgR类似物FlgZ通过调控铜绿假单胞菌鞭毛控制群集运动，高水平c-di-GMP与FlgZ结合，并与鞭毛定子MotC的相互作用，阻止鞭毛定子复合物MotCD与转子接触来抑制群集运动[18]。c-di-GMP代谢酶SadC、SadB、BifA均与群集运动有关，sadB位于sadC下游，研究发现sadC、sadB基因缺失会导致群集运动上调，相反bifA基因缺失引起群集运动丧失，目前认为SadC、BifA可能共同调节c-di-GMP水平，进而通过SadB控制群集运动[19-20]。铜绿假单胞菌的颤动是由菌毛通过延伸、附着、收缩的循环介导。过去发现具有GGDEF-EAL结构域的FimX与颤动有关[21]，最近研究发现c-di-GMP通过与FimX和PilZ形成三聚体复合物调控菌毛生成，进而控制颤动[22]，但具体机制仍不清楚。

2.2 生物膜基质的产生

初始附着后，细菌增殖并产生生物膜基质形成成熟的生物膜。生物膜基质在不同细菌中成分存在差异。c-di-GMP在生物膜基质的不同成分产生过程中发挥调控作用，如铜绿假单胞菌已鉴定的生物膜基质成分主要有多糖Psl、Pel和海藻酸盐。转录因子FleQ与c-di-GMP的结合形式激活pel和psl基因转录，并且这些多糖受到PelD（一种退化的GGDEF结构域蛋白）以及几种DGC和PDE酶在翻译后调控[14,23]。海藻酸盐不是生物膜形成的必需成分，但由于其能维持细胞水化，在限制水的条件下是生物膜形成所必需的组成部分[24-25]，因此，在肺囊性纤维化感染中起关键作用。研究发现肺囊性纤维化患者的气道呈脱水状态，这会促使铜绿假单胞菌从非黏液表型转化为产生海藻酸盐的黏液表型，引起患者肺功能和生存率的下降[26]。由此可见抑制海藻酸盐的生成有助于控制肺囊性纤维化患者的感染，并改善预后。海藻酸盐是由多种蛋白复合物参与合成的，其前体经内膜蛋白Alg8和Alg44（PilZ结构域蛋白）聚合，在细胞周质被多种蛋白修饰及装运，随后被分泌出细胞外发挥作用。过去研究发现c-di-GMP与Alg44结合可以激活海藻酸盐的合成，而这种激活依赖另一种内膜蛋白MucR（混合的EAL-GGDEF结构域蛋白）对局部c-di-GMP水平的调节。最近研究发现MucR介导硝酸盐依赖的海藻酸盐合成，并且GGDEF和EAL结构域对于海藻酸盐的合成均有重要作用[27]。

大肠埃希菌的生物膜基质卷曲纤维、纤维素和（β-1,6-N）-乙酰氨基葡萄糖（PGA）的合成也受到c-di-GMP调节。其中纤维素的合成过程存在c-di-GMP全局层面与局部层面的调控。RpoS（σ因子）诱导DgcE表达上调和PdeH的连续下调，引起细菌c-di-GMP整体水平升高。DgcM和PdeR构成局部控制模块，主要感应c-di-GMP水平升高，并激活转录因子MlrA，而非调节c-di-GMP水平[28]。活化的MlrA会激活中央卷曲调节器CsgD，进而诱导卷曲基因和dgcC的表达，前者合成卷曲纤维，后者合成DgcC使c-di-GMP局部水平升高，进而c-di-GMP通过与纤维素合成酶BcsA-BcsB结合使之变构激活合成纤维素[29]。PGA存在于多种细菌的生物膜基质中，在大肠埃希菌中发现后被命名为PGA，可以促进表面黏附和生物膜形成[30]。PGA的合成、分泌都需要c-di-GMP对PGA复合物变构激活。该复合物包括两种跨膜组分PgaA和PgaB，两种内膜组分PgaC和PgaD。pgaA基因（编码PGA复合物）以及编码DgcT和DgcZ两个DGC分子的基因dgcT和dgcZ都由Csr（carbon storage regulation system）控制，这是一个介导大肠埃希菌多种生理功能的碳储存调节系统，包括CsrA、CsrB、CsrC，其中CsrA对上述基因起抑制作用，而CsrB、CsrC对CsrA也存在抑制作用[31]。组氨酸激酶BarA受短链脂肪酸（醋酸或富马酸）的刺激，通过应答调节因子UvrY的磷酸化激活两个sRNA CsrB和CsrC的表达，抑制CsrA，从而使pgaA、dgcT、dgcZ基因表达，c-di-GMP水平升高，合成并分泌PGA。最近研究表明PgaCD是一种新型c-di-GMP受体，c-di-GMP可以直接与PgaC和PgaD结合激活PGA合成及分泌[32]。

2.3 生物膜扩散

随着生物膜老化，生物膜内的细菌扩散为浮游菌，并在其他地方形成生物膜，导致感染的迁延和慢性化，但浮游菌恢复了对抗生素的敏感性，有利于发挥抗生素治疗效果清除病原菌及病灶。这将为治疗生物膜相关感染提供一个新的思路。Morgan等[33]认为生物膜扩散是一个动态的、受到高度调控的过程，其由特定的环境信号触发，并受尚未表征的基因分层控制。Christensen等[34]通过过表达磷酸二酯酶基因yhjH，证实降低c-di-GMP水平可引起生物膜在体内外扩散。而一氧化氮（NO）和谷氨酸也被证明可以引起生物膜扩散，并与低水平c-di-GMP有关。进一步研究发现dipA、rbdA、bdlA基因在NO或谷氨酸诱导生物膜扩散中具有重要作用，但细菌如何感知环境信号（如NO），以及该信号如何引起c-di-GMP水平变化进而调控生物膜扩散尚不了解。最近研究发现在谷氨酸诱导扩散模型中，NicD可以感知谷氨酸信号，引起c-di-GMP水平升高进而顺序激活BdlA（一种传感器蛋白）和DipA（GGDEF-EAL结构域蛋白），最终引起c-di-GMP水平降低介导生物膜扩散[35]。对于c-di-GMP调控的生物膜扩散可能存在两种情况：①依赖游泳运动的主动逃逸，这与鞭毛基因表达上调及菌毛基因表达下调有关；②生物膜黏附性降低及生物膜基质合成减少引起的被动脱落[33]。Chatterjee等[36]在荧光假单胞菌中发现c-di-GMP调控黏附素LapA介导生物膜扩散。LapA结合在细胞膜上，介导表面黏附，维持生物膜稳定；LapG是一种周质蛋白酶，可切割LapA；LapD是一种跨膜蛋白，可调节LapG的活性。高水平c-di-GMP可与LapD结合，将LapG隔离在周质中使其不能切割LapA进而发挥黏附素作用。但c-di-GMP与磷酸盐水平相关，当磷酸盐不足时，c-di-GMP水平因RapA（PDE）表达而降低，LapD失活，LapG释放并切割LapA，促进生物膜扩散。目前关于c-di-GMP在生物膜扩散中机制研究尚较少，但是依据c-di-GMP在运动调节以及生物膜基质产生中发挥的作用，推测它在生物膜扩散中的作用必不可少。已经证实调节c-di-GMP水平，诱导生物膜扩散可以作为一种感染控制策略，接下来需要大量实验加以佐证及深入研究，希望成为解决生物膜感染的一条途径。

3 c-di-GMP与生物膜治疗

c-di-GMP介导的信号通路与细菌的多种生理功能密切相关，因此，调节c-di-GMP水平、阻断其信号传导对于研发新型抗菌药物具有重要意义。目前阻断c-di-GMP信号传导有三类潜在靶点，即c-di-GMP合成酶抑制剂、c-di-GMP降解酶抑制剂、c-di-GMP受体抑制剂[7]。如，Sambanthamoorthy等[37]利用霍乱弧菌中高水平c-di-GMP抑制荧光素酶 VC1673-lux表达这一特性，筛选出7个能抑制霍乱弧菌生物膜形成的双鸟苷酸环化酶抑制剂，其中一个分子DI-3表现出广谱抗生物膜活性。该研究者通过基于药效基团的高通量方法筛选出4个双鸟苷酸环化酶抑制剂，发现其不仅可以抑制生物膜形成，还可以使已经形成的生物膜扩散[38]。目前还未发现c-di-GMP降解酶抑制剂和c-di-GMP受体抑制剂存在抗生物膜作用。另外，PDE激活剂可通过降解c-di-GMP诱导生物膜扩散，Christensen等[34]证明此概念。NO在亚致死浓度下可通过结合NO敏感 H-NOX结构域蛋白，激活PDE而诱导多种细菌扩散，并且硝基氧化物（NO供体）与环丙沙星结合使用可有效地根除生物膜[39]。小剂量NO吸入在感染铜绿假单胞菌的肺囊性纤维化患者中可明显减少生物膜并提高治疗效果[40]。以上研究说明NO作为PDE激活剂，与抗生素联合使用可能是治疗生物膜相关感染的可行方法。但是需要探索安全、有效的诱导生物膜扩散的药物，然而，并不是所有的PDE都能调控生物膜的扩散，重要的是确保激动剂正确地激活具有已知扩散作用的PDE。此外，鉴于c-di-GMP可以触发先天免疫和适应性免疫反应，具有预防和控制感染的作用，c-di-GMP将有望成为疫苗，在预防和控制感染方面发挥重要作用。

4 总结

生物膜的形成使细菌能够适应各种不利的环境，因此也对临床上治疗造成极大困扰。近年来研究发现c-di-GMP通过与多种效应分子相互作用形成一个信息网络，参与并影响细菌的代谢及多种生理功能，尤其是在生物膜形成中，因此c-di-GMP可以作为抗生物膜药物的作用靶点。到目前为止，c-di-GMP对生物膜形成等多种生理功能的具体调控通路仍不明确,并且c-di-GMP的免疫调节功能、生物膜扩散、c-di-GMP抑制剂方面研究较少，仍需大量研究探索及佐证，这将可以对生物膜引起的感染提供一个治疗新思路。