阴道白假丝酵母菌生物膜形成、免疫逃避策略及治疗思路的研究进展*

牟一凡，史文华，沈 影，韩凤娟

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学附属第四医院妇产科，哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第一医院妇科，哈尔滨 150040)

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是临床常见的妇科疾病之一。近年来VVC在我国的发病率居高不下，约75%妇女一生中至少患过1次VVC，40%～50%的女性可患2次或2次以上，约5%～8%的患者发展为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)[1]。90%以上的VVC或RVVC患者是以感染白假丝酵母菌为主[2]。研究发现，VVC的发生与白假丝酵母菌生物膜的形成密切相关，生物膜是构成真菌毒力的主要因素，可促进真菌的黏附、增殖及扩散，且形成后不易清除，导致临床症状反复发作，治疗周期延长，难以根治，严重影响了女性的生活质量和身心健康。

1 白假丝酵母菌生物膜

白假丝酵母菌生物膜是由大量菌丝相细胞、少量酵母相细胞及细胞外基质(extracellular polymeric substances,EPS)组成的复杂结构，大量的菌丝相酵母菌可维持生物膜的完整性并构成生物膜的三维立体结构。

白假丝酵母菌生物膜的形成分为四个发展阶段：早期阶段(基底细胞黏附)、中间阶段(生物膜初步形成)、成熟阶段(生物膜成熟)以及扩散阶段(生物膜扩散)[3]。在早期阶段，酵母细胞黏附于阴道黏膜表面，此过程是生物膜形成的关键步骤，且黏附力的强弱与致病性和耐药性之间呈正相关[4]，随后酵母细胞通过增殖扩散产生菌落，进而形成生物膜的基底层。酵母细胞转变为菌丝相，Lagree等[5]观察发现，菌丝具有较强的黏附力，可形成高度缠绕的生物膜，具有侵袭性和毒性，这些特性增加了生物膜的厚度和复杂性。随着菌丝的出现和包裹着酵母和菌丝的EPS产生，生物膜的发展进入了高代谢活动的中间阶段。EPS作为生物膜重要的组成部分，为细胞的聚集和黏附提供一个支架并维持生物膜的结构，同时也是细胞吸收水分和营养的必经通道。在成熟阶段，细胞外基质物质大量积累，形成复杂的生物膜结构。生物膜形成的最后一步被认为是细胞的释放，脱落的酵母细胞作为种子传播，通过细胞增殖扩散形成新的生物膜，这也是播散性感染的原因[4]。

白假丝酵母菌生物膜成熟是VVC致病的基础。生物膜内存在简单的循环系统，有利于营养物质的交换，为生物膜内真菌提供适宜的生存环境，当生物膜内微环境高度协调，致密的胞间基质将假丝酵母菌包被其中，建立物理屏障，增强了对化学消毒剂、宿主防御等负性刺激的抵抗力，且人体宿主免疫系统不能有效将其清除。生物膜中有一部分致病菌处于休眠状态，此类致病菌其活性降低且EPS延缓抗真菌药物的渗透，有利于菌间发生表型转化以及耐药基因的形成、表达、进化及共享，表现出更强的耐药性，使VVC易于反复发作。

2 阴道局部免疫

为更好地理解生物膜状态下白假丝酵母菌免疫逃避机制，首先简单介绍免疫系统清除浮游态假丝酵母菌时发生的变化。当接触白假丝酵母菌后先天免疫系统快速激活，通过吞噬作用释放抗菌肽和细胞因子清除白假丝酵母菌。先天性免疫发挥作用后，是由T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的适应性免疫。

2.1 先天性免疫 外阴及阴道独特的解剖结构及生理特点是阻挡白假丝酵母菌入侵机体的重要天然屏障。清除白假丝酵母菌在很大程度上依赖于阴道黏膜上皮细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等先天免疫细胞的吞噬作用[6]，其中中性粒细胞发挥主要作用[7]。阴道黏膜表面上皮细胞是最先与白假丝酵母菌接触的细胞，通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR)与白假丝酵母菌上的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相结合，对其进行识别进而启动相关免疫应答[6]。中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞也表达PRR。PRR可分为3类：Toll样受体(toll-like receptor,TLR)、C型凝集素样受体(C-type lectin receptor,CLR)和甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)等。通过受体识别，刺激免疫细胞分泌抗菌肽(antimicrobial peptide AMP)、细胞因子和趋化因子，如IL-37、防御素、IL-1α、IL-1β、IL-6及IL-8等。IL-37能与白假丝酵母菌细胞壁结合，使其黏附能力下降。细胞因子和趋化因子可趋化中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞募集到感染部位。巨噬细胞吞噬假丝酵母菌，加工呈递特异性抗原，并分泌TNF-α和IL-1，募集并活化中性粒细胞，发挥吞噬和杀菌作用，中性粒细胞还能通过坏死或凋亡方式形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)，捕获并杀死白假丝酵母菌，NETs对清除假丝酵母菌至关重要[8]。

2.2 适应性免疫 阴道局部的特异性免疫，包括细胞免疫和体液免疫。(1)细胞免疫。T淋巴细胞及B淋巴细胞都参与细胞免疫应答，以T淋巴细胞更为重要。T淋巴细胞按其功能和表面标志可分为4个亚型，辅助性T细胞(Th)、杀伤性T细胞(Tc)、抑制性T细胞(Ts)及迟发型超敏反应T细胞[7]。其中以Th为代表的细胞免疫为主。Th细胞可在细胞因子诱导下分化为3种细胞Th1、Th2、Th17，进而调节免疫过程。Th1免疫反应在防御假丝酵母菌中起关键作用，产生的细胞因子，如IL-1、IL-2及IFN-γ可激活巨噬细胞和中性粒细胞[7]。Th17细胞分泌细胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22，使中性粒细胞募集到感染部位并驱动上皮细胞产生细胞因子、趋化因子和抗菌肽。抗菌肽具有抑制生物膜形成、破坏生物膜结构及杀死假丝酵母菌的能力。Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13，阻碍假丝酵母菌清除。目前普遍认为，Th1、Th17细胞可促进免疫对假丝酵母菌的清除，Th2则对病原菌清除起相反作用[9]。(2)体液免疫。阴道基底层的淋巴细胞群可产生各类抗体并分布于分泌液中，其中起重要作用的是sIgA，其他免疫球蛋白在抗感染中也起一定作用。研究表明[10]，在VVC患者的阴道灌洗液中，sIgA、IgG水平较健康组明显升高。在对小鼠的研究中发现，在假丝酵母菌初次感染和再次感染的任何阶段均可在阴道灌洗液中检测出假丝酵母菌特异性抗体sIgA及IgG。由此可见，体液免疫在清除白假丝酵母菌和防止其过度生长方面也发挥一定的作用。

3 白假丝酵母菌生物膜逃避宿主免疫机制

当生物膜形成并成熟后，能采用精准策略长期逃避宿主免疫细胞的识别和清除，使免疫系统无法清除生物膜，可总结为以下两方面。

3.1 生物膜抵抗宿主免疫 (1)干扰PRR识别。生物膜状态下，模式识别受体TLR2、TLR4含量减少。EPS包裹假丝酵母菌细胞壁表面的PAMP，阻止TLR2、TLR4识别假丝酵母菌，逃避免疫追踪。(2)阻碍中性粒细胞、巨噬细胞清除。与浮游状态相比，生物膜对中性粒细胞杀伤的抵抗力高出5倍以上，中性粒细胞对防御假丝酵母菌感染至关重要[8]，通过释放NETs，抑制真菌的生长和传播。在生物膜状态下，释放的NETs大幅度减少，而相比处于浮游状态的假丝酵母菌，中性粒细胞会在4h内释放大量NETs以清除致病菌。当通过物理或基因手段破坏EPS后，中性粒细胞又恢复释放NETs的能力。研究发现[8]，EPS中的葡聚糖阻止中性粒细胞形成NETs。此外，生物膜抑制中性粒细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。ROS是参与NETs生成的重要信号通路，与浮游状态相比，ROS含量减少4倍。这些研究表明，生物膜可通过直接与间接方式抑制NETs释放，有助于免疫逃避，为假丝酵母菌提供生存优势，但如能解决这种抑制作用，NETs将是破坏生物膜的有效方式[11]。生物膜结构保护白假丝酵母菌免受巨噬细胞的识别与杀伤，抑制巨噬细胞的迁移，并且菌丝相假丝酵母菌可通过物理穿透方式杀死巨噬细胞，从而使假丝酵母菌从巨噬细胞内逃逸[12]。(3)减少细胞因子、抗体分泌量。研究表明[12-13]，生物膜组细胞因子IL-1、IFN-γ及TNF-α表达量明显低于健康对照组，抑制吞噬细胞活化。Pra1、Gpd2、Msb2基因在生物膜形成过程中高度表达，Pra1、Gpd2基因能单独阻断补体激活，抑制阴道免疫球蛋白sIgA作用[14]。Msb2基因可编码一种黏蛋白，结合宿主分泌的抗菌肽，阻碍抗菌肽发挥作用。(4)破坏阴道组织结构。白假丝酵母菌可分泌细胞外水解酶，其中分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)被认为是最关键的毒力因子之一，因为它与宿主免疫系统的黏附、侵袭、组织损伤和逃避有关，能水解各种宿主蛋白质，破坏阴道黏膜屏障，细长的菌丝还可穿透组织造成组织损伤[2]。Sap还可降解补体因子C3b，从而抑制免疫细胞识别和吞噬。

3.2 生物膜促使免疫偏移，将有效免疫转化为无效免疫 Netea等[15]研究发现，生物膜可产生使免疫发生偏移的影响因子，这些因素可直接或间接驱动免疫偏移。

细胞因子IL-1、IFN-γ及TNF-α分泌减少，阻碍Th分化为Th1细胞，致使Th1型免疫应答减弱。细胞因子IL-4含量明显增高且白假丝酵母菌细胞壁成份诱导IL-10表达[15]，促进Th分化为Th2，触发Th2型免疫应答。

由此可见，生物膜成熟后，可通过阻止免疫细胞PRR识别，干扰中性粒细胞、巨噬细胞功能，降低细胞因子、趋化因子含量，破坏阴道局部黏膜组织，还可将有效免疫转化为无效免疫等方式逃避免疫系统的识别与清除，使免疫系统无法清除生物膜结构。

4 治疗思路

通过对生物膜的形成过程及免疫逃避策略的综述，可以得出，治疗VVC的关键在于干扰生物膜的形成及其作用发挥、提高阴道局部免疫力等方面。

4.1 干扰生物膜形成及其作用发挥 (1)干扰群体感应系统。研究发现，在生物膜的形成过程中，群体感应系统发挥着重要作用。群体感应(QS)是微生物之间的通讯机制，介导生物膜的形成。QS系统通过监测来控制整个细胞群体的生长、代谢等行为，以确保生物膜中微环境的稳态与代谢物的正常分泌，避免营养缺乏等，为菌体生长及生物膜形成提供保障。法尼醇是一种由白假丝酵母菌产生的胞外群体感应分子，而一定浓度的法尼醇可抑制酵母相至菌丝相的转换[16]，并且可把生物膜保持在静止状态从而抑制其生成[4]。Paluch等[17]研究了群体猝灭(QQ)技术，可中断微生物的交流。故可通过分子手段抑制信号分子的生成，研制信号分子竞争抑制剂等方式靶向破坏QS系统从而抑制生物膜形成。(2)抑制EPS形成。研究表明，EPS有以下功能：维持生物膜的稳定性；延缓抗菌药物渗透，使致病菌产生耐药性；抗宿主免疫作用。通过研制抑制EPS形成、破坏EPS的蛋白酶，阻碍生物膜功能的正常发挥。(3)阿司匹林。Alem等[18]在白假丝酵母菌生物膜形成的不同阶段加不同浓度的环氧酶抑制剂阿司匹林和前列腺素E2，发现其可抑制生物膜形成的各个阶段，且抑制程度与药物浓度成正相关，阿司匹林对成熟生物膜亦有抑制作用。(4)硼酸。有研究表明，硼酸具有抑制假丝酵母菌生物膜的作用。其作用机制为抑制生物膜形成过程中所需的氧化代谢反应，从而抑制生物膜形成[19]。(5)抗菌肽。Fais等[20]研究发现，抗菌肽hLFl-11可通过显著降低生物膜细胞密度和代谢活性，下调生物膜形成相关基因表达。MAF-1是经免疫诱导后从家蝇幼虫血淋巴中分离得到的一个新型抗真菌肽。罗振华等[21]研究发现，随着MAF-1药物剂量及作用时间的增加，抑制生物膜形成作用增强，菌丝形成减少，部分酵母菌出现一个或多个穿孔，严重的呈碎片状，正常的代谢反应发生紊乱。提示抗菌肽对生物膜形成具有较好的抑制作用。(6)其他。桑黄正丁醇提取物、白头翁汤正丁醇提取物、藁本挥发油、大蒜素、去甲亚精胺等均可抑制生物膜形成。

4.2 提高阴道局部免疫能力 (1)臭氧。臭氧对阴道局部的免疫反应具有促进作用。通过激活巨噬细胞和吞噬细胞的免疫应答，提高NK细胞的杀菌活性，增强局部组织抵抗力，臭氧还可对各类DNA依赖的细胞因子和抗体的产生具有促进作用，从而影响细胞免疫和体液免疫的作用，加快免疫调节[22]。(2)乳酸菌活菌制剂。乳酸菌活菌制剂可刺激宿主的阴道局部免疫，加强吞噬细胞的吞噬能力，增强T细胞的增殖、分化和产生细胞因子的能力，可在循环中诱导特异性IgG分泌，提高黏膜的屏障作用，增强宿主免疫防御功能。乳酸菌可降低VVC的患病率，研究发现德氏乳杆菌发酵上清液可显著抑制初始黏附和菌丝形成、降低胞外多糖的含量来抑制白假丝酵母菌生物膜的形成[23]。

5 结 语

综上所述，阴道免疫防御可清除浮游状态的白假丝酵母菌，恢复阴道微生态的平衡，进而控制阴道炎症。但当白假丝酵母菌生物膜形成后，通过一系列手段逃避免疫系统的识别与清除，使VVC反复发作。此外，生物膜的三维网状结构决定了生物膜本身抵抗力强，其内致病菌易产生耐药基因，使抗真菌药物治疗效果欠佳，导致治疗VVC难度进一步增加。通过提高阴道局部免疫与干扰生物膜形成及其作用发挥等方法，对治疗VVC有较好的临床效果。此外，应进一步研究生物膜的结构和成份、生物膜的作用机制，更深一步了解生物膜与VVC之间的关系，为未来靶向治疗VVC提供可能。