水芹治疗新型冠状病毒肺炎的网络药理学预测和分析

刘青川 曹文斌 杨新波 王仁杰 王蒙蒙 黄正明

北京卫健基业生物技术研究所药理室，北京 100039

新型冠状病毒肺炎疫情的暴发导致世界经济遭受巨大损失，人民健康受到严重威胁。2020 年2 月11 日，新型冠状病毒所致的疾病被WHO 正式命名为“2019 冠状病毒疾病”（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1]；新型冠状病毒被正式命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。截至2020 年9 月11 日，我国已累计报告确诊病例85 174 例，累计死亡病例4634 例[2]。海外疫情则更为严重，感染和死亡人数仍处于快速增长之势，疫情形势不容乐观。此次疫情中，中医药学结合了对“疫”病的治疗手段，在COVID-19 的预防和治疗中发挥了重要作用。中药水芹自《本草求真》《神农本草》《本草纲目》等古籍就有记载，具有清热解毒功能，主治黄病、小儿暴热等证。近代研究发现，水芹中含有丰富的黄酮类和酚酸类物质，这些活性成分对乙型肝炎和艾滋病等病毒感染性疾病具有良好的治疗作用，体内外实验结果均表明其可显著抑制病毒复制[3-4]；其作用机制与影响病毒DNA 聚合酶或逆转录酶的活性密切相关[5-6]。基于水芹抗病毒作用的研究，本研究运用网络药理学手段，研究水芹的作用靶标和信号通路，预测和分析其防治COVID-19 的可能性和潜在分子机制，为水芹治疗COVID-19 的实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库

TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Pre diction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；UniProt（http://www.uniprot.org/）；疾病靶点数据库：TTD（http://db.idrblab.net/ttd），OMIM（https://www.omim.org/），Drugbank（https://www.drugbank.ca/），GeneCards（http://www.genecards.org）；STRING（https://string-db.org）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 获取水芹活性成分靶点

通过北京卫健基业生物技术研究所研究和文献查询[7-9]，选取水芹的7 种活性成分：绿原酸、咖啡酸、芦丁、山奈酚、槲皮素、异鼠李素、金丝桃苷。在TCMSP 数据库获取各活性成分的靶点。用PubChem获取各成分化学结构并导入Swiss Target Prediction中，预测各成分相关靶点。将两个数据库检索结果筛选合并，得到活性成分潜在靶点。

1.3 疾病靶点获取

4 个疾病靶点数据库以“COVID-19”“novel coronavirus pneumonia”“SARS-COV-2”进行检索，将检索结果合并，去除重复，得到COVID-19 相关疾病靶点。

1.4 获取活性成分-疾病共有靶点

将活性成分靶点和COVID-19 的疾病靶点取交集，获得活性成分-疾病共有靶点。

1.5 构建水芹活性成分-靶点网络图

将共有靶点输入STRING，限定种属“Homo sapiens”，设置最低置信度0.4，得到活性成分-靶点的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。将得到的STRING 文件导入Cytoscape 3.7.2 软件，制作PPI 可视化图，分析水芹对COVID-19 的关键靶点。

1.6 活性成分-靶点网络的构建

将水芹活性成分和关键靶点导入Cytoscape，构建“活性成分-靶点”网络图。

1.7 GO 和KEGG 富集分析

将活性成分-疾病共有靶点输入DAVID 数据库，获得基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析数据。GO 分析包含分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）、细胞学组分（cellular components，CC）三部分。分别选取GO、KEGG 前10 条主要信息，用R Studio 对数据进行分析和计算，绘制气泡图。

1.8 构建“靶点-信号通路”网络图

将KEGG 富集分析结果和相关靶点导入Cytoscape 软件，制作“靶点-信号通路”网络图。

2 结果

2.1 水芹活性成分和靶点预测

水芹的7 种活性成分中有部分成分已报道与COVID-19 治疗密切相关[10]，故部分成分没有按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物类药性（drug likeness，DL）≥0.18 进行筛选。分析得到水芹各成分靶点数见表1，所有靶点经合并筛选后共有306 个。

表1 水芹中活性成分信息和潜在靶点

2.2 水芹防治COVID-19 疾病靶点的筛选

通过检索4 个疾病靶点数据库，筛选去重，获得COVID-19 相关靶点355 个，用UniProt 进行转化。将水芹活性成分靶点与COVID-19 靶点相互交集，得到活性成分-疾病靶点共60 个。见表2。

2.3 活性成分-靶点PPI 网络

通过STRING 数据库和Cytoscape 制作PPI 可视化网络图，结果显示，网络中有60 个节点，778 条连接边，节点的颜色深浅和形状大小与度值呈正比，分析得到20 个核心基因，其中TNF、IL-6、MAPK1、CASP3等为水芹活性成分与COVID-19 相关的关键靶点。见图1。

表2 活性成分-疾病共有靶点信息

2.4 活性成分-靶点网络分析

采用Cytoscape 进行分析，结果发现，网络中共67 个节点（含活性成分和靶点），共110 条边，其中重要靶点为TNF、IL-6、MAPK1、CASP3 等。见图2。

图1 活性成分-靶点的蛋白-蛋白相互作用可视化网络图

图2 活性成分-靶点网络

2.5 GO 和KEGG 通路富集分析

采用DAVID 数据库进行GO 分析，得到497 个条目，分别选取排名前10 条目，绘制气泡图，见图3。BP 涉及炎症反应、细胞凋亡、免疫应答等；MF 涉及蛋白质结合、酶结合、细胞因子活性等；CC 涉及细胞质、质膜、细胞核、线粒体等。提示水芹活性成分可以通过调控多种生物学途径防治COVID-19。

图3 GO 富集分析气泡图

KEGG 通路富集分析获得116 条信号通路。选取排名前10 条目，绘制气泡图，见图4，其中密切相关的通路主要有TNF、Toll 样受体信号通路等。提示水芹防治COVID-19 的作用多样性。

图4 KEGG 通路富集分析气泡图

2.6 “靶点-信号通路”网络

选取前10 条KEGG 通路，将每个通路的靶点合并去重，得到43 个靶点。用Cytoscape 建立“靶点-通路”网络图，拓扑学分析发现，图中共53 个节点（靶点43 个、通路10 个）、192 条连接线，网络密度为0.139，网络异质性为0.889，其中最为密切的是TNF 及其信号通路、Toll 样受体信号通路，在COVID-19 中发挥着重要作用。见图5。

3 讨论

图5 “靶点-信号通路”网络图

网络药理学是Hopkins[11]于2007 年提出的概念，依靠数据库信息和计算机的辅助，对药物治疗疾病的作用靶点和通路进行初步预测[12]。SARS-CoV-2 具有传染性强、潜伏期长、伪装性强、攻击免疫系统、感染者无症状等特点[13]，加大了COVID-19 科研工作的风险和难度。自疫情暴发以来，以网络药理学为手段对中药防治COVID-19 的研究大量涌出，该方法为中药治疗COVID-19 提供了理论基础，拓展中药研究新的研究思路，促进中药现代化的进展[14]。

SARS-CoV-2 感染过程中会过度激活宿主免疫应答，释放细胞因子和趋化因子，引发“细胞因子风暴”，造成肺部器官病变[15-16]。中药对COVID-19 的治疗主要通过解热、抗感染、抗病毒、免疫调节等多途径，缓解细胞因子风暴，达到治疗作用[17-19]。细胞因子风暴中，TNF 可促进炎症反应，调控细胞的增殖、存活、分化和凋亡[20]。TNF 信号通路里MAPK、NF-κB 信号通路的激活可导致促炎基因表达，诱导细胞凋亡和造成组织损伤[21]。水芹中芦丁、槲皮素、山奈酚、金丝桃苷均参与TNF 信号通路的调控，可能通过下调NF-κB 信号转导通路或MAPK 信号通路的活化，降低TNF-α、IL-6、CAPS3 等因子的释放，缓解免疫反应，降低肺炎症程度[22-23]。Toll 样受体是固有免疫病原模式识别受体，可识别激活天然免疫系统来抵抗病原微生物的入侵。Toll 样受体通路中也有NF-κB、MAPK信号通路的参与，且NF-κB 是其下游枢纽，参与炎症调节、免疫反应等[24]。水芹上述成分也可通过调节Toll样受体通路、阻止NF-κB 磷酸化释放进入细胞核，调控TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎症因子的转录，减轻炎症症状。有报道显示，绿原酸也可以通过抑制机体的NF-κB 活化，促进病原体侵染细胞的凋亡[25]。此外，芦丁、金丝桃苷与新冠病毒的主要蛋白酶可通过非极性相互作用结合，抑制蛋白酶的活性，达到抗病毒效果[10]。

本研究以网络药理学方法，对水芹治疗COVID-19的可能机制进行预测和分析，发现水芹可参与TNF和Toll 样受体通路的调控，调节TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生。水芹中活性物质不仅限于本研究中的成分，其有效部位水芹总酚酸含量达到50%以上，除含上述成分外，尚有未明确的成分有待研究。如将水芹系统全面地论证，仅用网络药理学的方法是有缺陷和不足的，本研究结果可为水芹后期的实验研究指引方向和提供理论基础。