基于网络药理学和分子对接探讨当归建中汤治疗痛经的作用机制

段玺, 王珂, 苏肖, 刘凯乐, 刘佳欢, 王娟, 韩立柱, 汪芸兰, 宋逍

(1.陕西中医药大学附属医院检验科，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046)

痛经是指女性在月经前后或月经期间所表现出来的小腹及腰部疼痛甚至剧痛难忍，常伴有面色苍白、头面冷汗淋漓、呕吐等症状，是妇科最常见的疾病之一[1]。全国妇女月经生理常数协作组的报告显示，女性痛经的发生率为33%，国外资料用不同的统计方法发现青少年女性痛经的发病率为20%～90%，其中15%有重度痛经[2]。目前治疗痛经的西药主要是非甾体类抗炎药物，其通过阻断环氧化酶通路、抑制前列腺素类物质合成，达到镇痛作用[3]，药效持续时间短，长期服用易引起胃肠道等不良反应，多数患者不能耐受[4]。中医将痛经分为气滞血瘀、寒凝血瘀、湿热蕴结、气血虚弱、肾气亏损五种证型。“不通则痛”、“不荣则痛”是痛经的基本病机。原发性痛经气血虚弱证是临床常见的证型之一，该类患者素体虚弱，气血不足，或大病久病，耗伤气血，或脾胃虚弱，化源不足，气虚血少，经行血泄，治法主要以益气养血止痛、温经散寒、活血化瘀止痛为基本原则，临床疗效较为稳定[5]。当归建中汤(Danggui Jianzhong Decoction, DGJZD)出自《宋·太平惠民和剂局方》，由当归、甘草、肉桂、白芍四味药组成，当归补血养血活血，甘草偏于生津，肉桂辛酸温通，白芍补血缓急，主治血气虚损，痛引腰背，时自汗出，不思饮食，全方既补血又温中补虚，在临床上常用于气血虚弱所致的痛经，但目前关于当归建中汤的研究主要在药效物质基础和临床病例研究，其治疗痛经的有效成分和作用机制需要进一步探究。

网络药理学能够从整体的角度探索药物与疾病间的关联性，通过构建“药物-靶点-疾病”网络，结合分子功能、生物学过程分析，对分子层面的作用机制进行解释，为药物的研发提供新的策略[6]。目前有诸多研究运用网络药理学研究思路进行中药单味或复方的作用机制研究，并取得了丰富的研究成果[7]。李杰等[8]通过网络药理学探讨了四物汤治疗原发性痛经的作用机制；韩彦琪等[9]基于网络药理学对元胡止痛滴丸治疗原发性痛经的配伍合理性进行研究；本研究采用网络药理学的研究方法，依据中医整体观，系统地对当归建中汤治疗痛经的作用机制进行探讨，并利用分子对接技术对当归建中汤中化合物和受体分子进行虚拟结合，发现其作用靶点和结合位点，阐述当归建中汤多成分、多靶点、多通路的协同作用机制，为后续的深入研究提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物有效成分筛选

通过TCMSP(http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库及查阅相关文献筛选当归建中汤(当归、甘草、肉桂、白芍)的有效成分信息，并找出其作用靶点，在Uniport数据库(https:∥www.uniprot.org/)中输入靶点名称并限定物种为人，对靶点进行蛋白名称标准化，得到药物的潜在靶点。

1.2 疾病靶点的获取

以“dysmenorrhea”为检索词在CTD(https:∥ctdbase.org/)，DisGeNET (https:∥www.disgenet.org/)，Drugbank(https:∥www.drugbank.ca/)数据库中检索相关靶点。

1.3 网络构建及分析

利用Venny 2.1.0 绘制韦恩图获得当归建中汤与组分及痛经靶点交集，即为当归建中汤治疗痛经的可能作用靶点，将交集靶点在生物分子功能注释系统STRING(https:∥string-db.org/)数据库中建立 PPI 蛋白互作网络，并根据结果对其进行分析。

1.4 功能富集分析与通路分析

采用R语言中clusterProfiler程序包对共有的靶标进行GO富集分析和 KEGG 通路分析，当归建中汤对应的靶蛋白直接映射到通路上，药物靶点富集的通路即药物治疗的通路，并绘制气泡图可视化。将药材、活性化合物、靶点、通路用Cytoscape 3.7.0软件，构建“药材-成分-靶点-通路”可视化网络图，探究当归建中汤活性成分的“多靶标-多通路-多层次”的治疗作用。

1.5 分子对接分析

在PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中得到当归建中汤中化合物的3D结构；从RCSB PDB(http:∥www.rcsb.org/)数据库中筛选得到核心靶蛋白的晶体结构，去除水分子和配体小分子，分离出潜在蛋白的结构。采用AutoDock 4.2.6软件中遗传算法进行半柔性对接，盒子中心坐标和大小根据蛋白质分子的活性位点位置和其对配体小分子可能发生作用的区域进行设定，其余参数保持默认，对化合物和靶标蛋白进行分子对接分析。

2 结果

2.1 当归建中汤有效成分及靶点的筛选

运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)搜索关键词“当归、甘草、白芍、肉桂”[10]，再根据OB，DL的取值筛选后得到110个有效成分，其中当归44个，肉桂12个，甘草41个，白芍13个，剔除重复后得到当归建中汤有效成分83个，见表1，在Uniport数据库对靶点蛋白名称标准化后得到药材成分的潜在作用靶点184个。

表1 当归建中汤有效成分及靶点

续表1

2.2 当归建中汤靶点与痛经靶点交集分析

通过CTD、DisGeNET、Drugbank数据库检索合并去重得到300个与痛经相关的靶点，将药材的靶点与疾病的靶点做交集，映射后获得当归建中汤与痛经的共有靶点29个，绘制韦恩图，见图1。

图1 当归建中汤靶点与痛经交集靶点

2.3 构建当归建中汤“药材-有效成分-靶点”网络

根据上述所得结果，利用 Cytoscape 软件构建“药材-有效成分 -靶点”网络，见图2。该网络图中共包括116个节点,其中83个药物活性成分节点、29个靶蛋白节点和4个药材节点，每条边表示单味药与活性成分、活性成分与作用靶点之间的关系，其中蓝色节点代表药材，紫色代表活性成分，绿色代表作用靶点[11]。

2.4 构建活性靶点PPI网络

将交集靶点导入STRING数据库中，设定物种为“Homo sapiens”，进行蛋白质互作分析，利用 Cytoscape 构建PPI网络图，一个节点代表一个靶点，节点大小程度反映度值(Degree)的大小，边代表靶点彼此的作用关系，最终得到PPI网络分析图[12]，见图3。

图2 当归建中汤“药材-有效成分-靶点”网络

图3 靶蛋白互作网络图

2.5 靶点KEGG富集分析

KEGG数据库包含了细胞和生物高级功能的注释，包括KEGG路径图，BRITE层次结构和KEGG模块[13]。利用KEGG将当归建中汤对应的靶蛋白映射到通路上，分析药物活性、靶点和通路。其中信号通路主要包括代谢、细胞色素、压力等方面，如细胞色素P450对异生物素的新陈代谢、药物代谢-细胞色素P450、流体剪切应力与动脉粥样硬化，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，其他通路如TNF信号通路、IL-7信号通路等。KEGG富集通路分析得到93条通路，排列前20个富集分析见图4。

2.6 GO富集分析

GO描述了基因产品(蛋白质或RNA)参与的生物学过程，分子功能和细胞组成[14]，并将概念粗细不同的功能概念组织成图集进行分析，根据P值排序，结果见图5。图中横坐标为富集基因的个数，柱的颜色代表P值的大小，颜色由蓝到红，P值由大变小，并将概念粗细不同的功能概念组织成图集进行分析。其过程主要集中在生物学过程，共有639个富集结果，主要涉及对氧化合物反应、对脂质反应、对激素反应、对化学物质反应、对有机物质反应、活性氧代谢正调控等方面；分子功能中共富集到70条结果，与氧化还原酶活性、木糖还原酶活性等酶活性方面有关；细胞组成有24条富集结果，其与细胞质、细胞外区域外部分及参与细胞膜结构等有关。

2.7 药材-成分-靶点-通路网络分析

利用Cytoscape 3.7.0中的Merge功能将药材-成分-靶点网络合并，得到药材-成分-靶点-通路网络图，见图6。网络中有4个节点表示药材，78个节点表示有效成分(去除没有与靶点直接相连的成分)，24个节点代表与痛经相关的疾病靶点(去除游离的蛋白点)，20个节点代表与痛经靶点相关的通路。由网络分析图可知，有效成分中连接边数较多的为山柰酚、芒柄花素、儿茶素和刺果甘草查耳酮；潜在靶点中PTGS2、GSK3B、ESR1、MAOB连接较多边数；通路中如流体剪切应力与动脉粥样硬化、药物代谢-细胞色素P450、肿瘤坏死因子素信号通路与潜在靶点有较多的连接。结合蛋白相互作用网络，对数据进行拓扑分析，发现ESR1、PTGS2、GSK3B节点度值显著高于其他靶点，预测ESR1、PTGS2、GSK3B可能是治疗痛经的核心靶点。

粉色：药材；绿色：药材有效成分；蓝色：通路；橙色：作用靶点

2.8 分子对接结果

分子对接是模拟配体小分子和受体生物大分子之间的相互作用，得到其最佳结合位置和结合强度，预测其亲和力。根据当归建中汤“药材-成分-靶点-通路”网络中靶点与成分连接的度值，药材成分中芒柄花素、山柰酚和儿茶素与痛经的潜在靶点ESR1、PTGS2、GSK3B进行分子对接分析，分子之间结合能量较低的构象则较为稳定，筛选对接结果中结合能低的分子构象即为最优对接结果，并分析其结合位点，见表2和图7。对接结果显示，芒柄花素与三个受体大分子都能够较好的结合，与PTGS2中氨基酸残基Asn382和Trp387结合能分别为-3.219 kcal·mol-1和-3.259 kcal·mol-1，表明其具有良好的亲和力。ESR1与儿茶素和芒柄花素之间能够形成氢键，具有稳定的结构。

表2 儿茶素、芒柄花素和山柰酚与痛经潜在靶点结合能

A：儿茶素和ESR1；B：儿茶素和PTGS2；C：芒柄花素和PTGS2；D：芒柄花素和GSK3B；E：芒柄花素和ESR1；F：山奈酚和PTGS2

3 讨论

中医药是利用辩证和整体的思维模式来治疗疾病，中药或中药复方具有多组分，能够通过多途径、多靶点、多环节发挥整体调节作用[15]。本文基于网络药理学和分子对接的方法，对当归建中汤治疗痛经进行了较系统的预测分析，其中PTGS2具有扩张小血管、增加微血管通透性与其他炎性介质协同作用多种致炎机制，研究表明，痛经的根本原因为前列腺素含量的改变。孕激素可促进雌二醇转化为无活性的雌酮，使前列腺素的生成受到抑制，舒张子宫平滑肌而缓解痛经[16]。ESR1(雌激素受体)和类固醇激素受体均为核受体，核受体与相应的配体及其辅调节因子相互作用参与调控真核细胞基因的表达，影响靶细胞的增殖和分化。血液循环中的雌激素可靶向作用于单核细胞谱系、减轻相应的免疫反应。相关研究报道雌激素含量增加会间接促进PGF2α的合成和释放，导致子宫收缩、血供不足引起痛经[17]。AKR1C3可以使活性雄激素、雌激素和孕激素与它们的同源无活性代谢物相互转化，雄激素、雌激素和孕激素相互作用，增强机体耐经期疼痛能力。经期机体代谢能力增强，机体内脂消耗速率加快，但是在月经期间胃部可能会积食，CYP1A2通过蛋白激酶发出的信号导致Jak激酶活化，Jak激酶的活化可以减少由胃部带来的疼痛。经期与孕激素受体(PGR)相关，如果孕激素活化、分泌多，会减少由激素带来的不适，而且类固醇激素及其受体参与真核基因表达的调节，并影响靶组织中的细胞增殖和分化。F2为凝血酶原，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、与凝血酶调节蛋白配合，对多种凝血因子具有水解作用，蛋白C在血液稳态、炎症和伤口愈合中发挥作用。单胺氧化酶B(MAOB)存在于神经元、星形胶质细胞及血小板中，可催化生物胺和异生物胺的氧化脱氨，在中枢神经系统和外周组织的神经活性及血管活性胺的代谢中发挥重要作用。由此推测，当归建中汤治疗痛经的作用机制可能与炎症反应、激素调节、细胞生长及中枢神经系统调节相关。

对靶点相关的信号通路分析可知，SELE、HSP90AA1、GSTM2、GSTM1、NF、VCAM1、EDN1可作用于流体剪切应力和动脉粥样硬化通路，在流体剪切应力降低的情况下，血管内皮细胞分泌的缩血管活性物质、血小板源性生长因子、炎症介质、促血管内皮细胞增生和凋亡的活性物质可促进细胞增生和血细胞黏附，进而导致动脉粥样硬化的发生[18]。雌激素信号通路，孕烯醇酮和黄体酮是三类固醇的原料，糖皮质激素和盐皮质激素的C21类固醇，雄激素的C19类固醇和雌激素的C18类固醇，有相关文献报道，痛经与月经周期中的性激素变化密切相关[19]。胰岛素抵抗和血管内皮功能障碍二者之间相互影响、相互促进，形成恶性循环，造成动脉粥样硬化、炎症性血管疾病，月经期间疼痛加剧，经期血块堆积[20]。胰岛素抵抗使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性地分泌过多，能够引起高胰岛素血症，造成过度肥胖，会引起月经紊乱、不孕不育、痤疮等症状[21]。进一步通过GO功能富集分析，可以发现当归建中汤治疗痛经的作用机制涉及多个生物学过程，主要集中在物质氧化代谢、酶活性、激素调节等方面。

综上，当归建中汤治疗痛经不仅抑制前列腺素的生成，而且调节其他与痛经相关的病理过程，如血小板聚集、血管相关因子及炎症因子的表达，从而抑制血栓形成，促进组织修复，调节子宫的收缩性，温补气血，达到缓解痛经的目的。本研究基于当归建中汤中药材的化学成分及靶点对其作用机制进行网络分析及分子对接分析，为当归建中汤治疗痛经的作用机制提供理论依据。