早产合并认知障碍大鼠粪便短链脂肪酸水平变化

薛正阳，卢红艳，唐炜，乐涛

(江苏大学附属医院儿科，江苏 镇江 212001)

研究发现，肠道菌群改变与认知发育异常存在明显相关性[1]。人类肠道菌群多样性和丰度下降与自闭症发生密切相关[2]，且与粪便短链脂肪酸含量变化有关。短链脂肪酸是一组少于六个碳的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，前三者占肠道中短链脂肪酸95%以上。对自闭症患儿的研究发现，主要产丁酸的肠道菌群丰度降低，产戊酸相关细菌丰度增加，粪便中乙酸和丁酸含量较低，戊酸水平较高[3]。腹腔注射丁酸钠可减轻自闭症小鼠社交功能缺陷[4]。另一项研究发现，抑郁症患者粪便中乙酸及丙酸明显较低，将其粪便微生物群移植到缺乏微生物群的大鼠身上会传播焦虑样行为[5]。以上研究结果提示，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸可能直接影响大脑功能。目前，粪便短链脂肪酸变化是否会导致早产后认知障碍尚不明确。本研究应用高通量测序与气相色谱技术定量检测早产认知障碍大鼠粪便肠道菌群以及短链脂肪酸含量，探讨肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸与早产后认知障碍发生的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂与仪器

60只SPF级健康孕16～17 d SD孕鼠，11周龄，体质量(410±40) g，由江苏大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(苏)2013-0036。

脂多糖(美国Sigma公司)；Morris水迷宫实验相关仪器由江苏大学医学院实验室提供；Illumina MiSeq测序仪(美国Illumina公司)；Onedrop仪器(南京五义科技有限公司)；GC-14B型气相色谱仪(日本Shimadzu公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理 认知障碍大鼠模型制备参考本实验室方法[6]。将60只孕鼠随机分成实验组与对照组，每组30只，实验组连续2 d腹腔注射脂多糖，对照组注射PBS；孕21 d(足月为22～23 d)对两组孕鼠行剖宫术取出早产大鼠，获得30只实验组早产大鼠和15只对照组早产大鼠。通过定位航行实验，从实验组早产大鼠中筛选出21只得分低的早产大鼠作为认知障碍组，从对照组早产大鼠中筛选出10只作为对照组。比较两组大鼠在定位航行实验中找到平台平均时间，采集大鼠粪便，并于-80 ℃保存待用。

1.2.2 高通量测序检测肠道菌群 粪便肠道菌群检测采用高通量测序16S rRNA检测方法[6]，提取的基因组建库后，在MiSeq平台上进行300×2 bp测序，该测序服务由天益健康科学研究院(镇江)有限公司提供。

菌群数据应用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3软件，与细菌数据库Silva(v129)，生成各样品分类学数据。采用PICRUSt方法，分析各样品中菌群代谢基因丰富度及多样性。

1.2.3 气相色谱技术检测粪便短链脂肪酸含量 取1 g粪便样本，加入超纯水5 mL，振荡混匀；取 1 mL上清液，按照5 ∶1加入偏磷酸巴豆酸混合溶液(内标)，-20 ℃保存过夜；解冻后12 000 r/min离心10 min；取上清液再加入样品1 mL，迅速振荡摇匀。测定前再12 000 r/min离心10 min；取上清液直接进样，用 1.0 μL微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2～1.0 μL。通过标准样品和内标巴豆酸各自的峰面积计算出各个样品中乙酸、丙酸及丁酸浓度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 定位航行实验

早产认知障碍大鼠找到平台的平均时间[(40±5)s]明显长于对照组[(18±4)s，t=13.29,P<0.01]。

2.2 大鼠粪便肠道菌群多样性指数分析

Chao1及Ace指数常代表菌群丰富度，Shannon 指数及Simpson 指数常代表菌群多样性。认知障碍组Chao1、Ace及Shannon指数明显低于正常对照组 (P均<0.05)，两组间Simpson 指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组大鼠肠道菌群丰富度及多样性指标比较

2.3 大鼠粪便肠道菌群分析

从门水平而言，拟杆菌门与厚壁菌门构成所有样本中主要优势菌群。其中，认知障碍组变形菌门丰度较对照组增加(P<0.05)，其他菌门比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。从目、属水平而言，与对照组比较，认知障碍组大鼠肠道中乳杆菌属、拟杆菌目明显降低(P均<0.05)。见表3。

表2 两组大鼠肠道菌群门水平优势菌群比较

表3 两组大鼠肠道菌群目、属水平优势菌群比较 M(P25，P75)，%

2.4 两组大鼠粪便短链脂肪酸变化

经检验分析，认知障碍组总短链脂肪酸与乙酸水平明显低于对照组(P均<0.05)，其他短链脂肪酸差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 两组大鼠粪便短链脂肪酸含量比较 M(P25，P75)，μmol/g

2.5 粪便短链脂肪酸与代表菌属的相关性分析

将认知障碍组大鼠短链脂肪酸与肠道菌群进行Spearman相关分析发现，乳酸杆菌、拟杆菌与乙酸呈一定的正相关(r=0.488，0.361，P均<0.05)。

3 讨论

定位航行实验是一种研究动物大脑认知功能的经典实验手段。本研究结果显示，在定位航行实验中，与对照组相比，早产认知障碍大鼠找到平台的平均时间明显延长，提示造模成功，表明认知障碍组存在认知障碍。

SD大鼠1月龄与人类2～5岁即幼儿期等同，此时能充分评估认知功能发育正常与否，且Morris水迷宫实验是评估啮齿类动物认知障碍的金标准，故早产大鼠出生30 d后，通过Morris水迷宫实验中的定位航行实验，可证明早产大鼠是否存在认知障碍。

肠道菌群结构的改变与认知障碍联系紧密。Liu等[7]研究发现，与对照组相比，认知障碍患者肠道菌群多样性下降。Kelly等[8]发现，患有认知障碍疾病患者肠道菌群数量与多样性较健康者显著降低。Cattaneo等[9]发现，轻度认知障碍患者体内变形菌门丰度增加。以上研究表明，认知障碍患者肠道菌群结构发生明显变化。本研究发现，与对照组相比，认知障碍组早产大鼠肠道菌群丰富度及多样性下降，拟杆菌门及厚壁菌门这两种优势菌门丰度降低，变形菌门丰度明显增加，同样提示认知障碍大鼠肠道菌群结构发生明显变化，表明肠道菌群结构改变可能是早产合并认知障碍的重要原因。

肠道中乳杆菌及拟杆菌与认知功能障碍关系密切。Yu等[10]发现，抑郁症模型大鼠乳杆菌水平相对丰度较低；Saji等[11]发现，认知功能障碍患者拟杆菌水平较低。本研究对肠道菌群分析，同样发现认知障碍组早产大鼠肠道拟杆菌目及乳杆菌属丰度明显减低。妊娠20周至产后3岁为脑发育关键期，而肠道菌群的定植也发生在该关键窗口期。在该窗口期内，若肠道菌群紊乱，短期有感染增加和炎症进程延长风险，长期可导致神经发育异常。

肠道菌群产生的短链脂肪酸对大脑功能和行为有显著影响。小胶质细胞在大脑发育、可塑性和认知方面起关键作用。Erny等[12]研究显示，短链脂肪酸能促进大脑小胶质细胞发育，影响少突胶质细胞前体细胞分化和髓鞘形成。在无菌模型小鼠中[12]，短链脂肪酸受体缺失，大脑小胶质细胞整体缺陷，提示短链脂肪酸是调节小胶质细胞成熟和功能的关键分子。此外，血脑屏障形成也与短链脂肪酸有关[13]，由细菌产生的短链脂肪酸可降低血脑屏障通透性。给无菌小鼠补充可产生短链脂肪酸的细菌，小鼠血脑屏障恢复正常，提示调节短链脂肪酸含量，就有可能维持血脑屏障功能[13]。本研究中，认知障碍组总短链脂肪酸水平与乙酸水平明显低于对照组，也表明短链脂肪酸减少对大脑认知功能形成产生影响。

乳杆菌与拟杆菌是常见的产乙酸菌。研究表明，口服乳酸杆菌12周可明显改善认知功能[14]。阿尔茨海默病模型小鼠的粪便和脑组织短链脂肪酸含量降低，而通过口服乙酸盐能改善小鼠脑神经损伤及认知功能障碍[15]。由此提示，总短链脂肪酸及乙酸含量下降可能会导致认知功能障碍，且总短链脂肪酸及乙酸浓度降低可能与乳杆菌降低有关[16]。本研究分析发现，乙酸与拟杆菌目、乳杆菌属呈一定正相关性，提示早产合并认知障碍大鼠肠道内乙酸含量下降可能与拟杆菌目、乳杆菌属含量下降有关。拟杆菌目、乳杆菌属水平下降所导致的总短链脂肪酸及乙酸水平下降可能导致早产合并认知障碍。研究发现，大鼠自闭症样行为可由脑室内高浓度丙酸引起[17]。Liu等[3]研究发现，自闭症患儿粪便中丁酸含量较低。本研究中，认知障碍组丙酸与丁酸含量与对照组相比无统计学差异，表明丙酸及丁酸改变是否与早产后认知障碍有关尚需进一步研究。本研究建立于动物模型，短链脂肪酸是否造成人类早产合并认知障碍，需要进一步的人体试验论证。此外，本实验缺乏粪群移植等干预手段；未来研究可增加干预手段，多角度观察论证菌群及其代谢产物与早产认知障碍的关系。

综上所述，早产认知障碍大鼠的肠道菌群特征为变形菌门富集与拟杆菌目、乳杆菌属含量降低。其拟杆菌目及乳杆菌属低丰度所致总短链脂肪酸与乙酸下降可能导致早产合并认知功能障碍。