醇沉金蝉花粗多糖对宫颈癌细胞的增殖抑制作用及可能机制

吕万林，周红秋，朱益灵，王一姝，魏渊，欧阳臻

(江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

金蝉花(Cordycepscicadae)又名蝉蛹草、蝉草、蜩、蝉茸等，为麦角菌科真菌蝉草及其寄主山蝉若虫形成的干燥复合体，其性寒味甘，具有定惊镇痉，散风热，眼疾消炎等作用[1]。金蝉花与无性型冬虫夏草同属，具有的功能活性组分相似[2]，但冬虫夏草生长在条件严苛的青藏高原[3]，而金蝉花一般生长于海拔为200～400 m的苦竹林或海拔750～900 m的针阔叶混交林地区，在我国主要分布在江苏、台湾、海南、四川、福建、浙江、云南和广东等地[4]。因此，金蝉花有望成为冬虫夏草的代用品，改善冬虫夏草资源稀缺状况，发展成为新的保健品、药品。

现代药理学研究发现金蝉花具有肝损伤保护[5]、肾脏保护[6]、抗肿瘤[7]、免疫调节[8]、抗氧化[9]、降血糖[10]等多种药理作用。多糖作为许多中药的主要活性成分，其抗肿瘤活性受到医药科研工作者的青睐。据报道，金蝉花不同纯化组分单独使用均对人肺腺癌PAA-1细胞具有抑制作用；联合化疗药物使用后则呈现不同的效果，总多糖表现为抑制作用，而腺苷则起协同作用[11]。王育纯等[12]连续10 d给S180肉瘤鼠灌胃金蝉花水煎液(20 mL/kg)，肿瘤抑制率达22.5%。且研究发现金蝉花水提取液的抗肿瘤活性要高于虫草头孢菌、蝙蝠蛾拟青霉菌和蛹虫草水提液[13]。Wang等[14]实验表明金蝉花水提取物(0、100、250、500和1 000 μg/mL)通过作用于G2/M期细胞周期并以剂量依赖的方式抑制人肝癌MHCC97H细胞的生长，但没有凋亡迹象。Xie等[15]研究表明，金蝉花乙醇提取物对人肺腺癌A549细胞、宫颈癌Hela细胞、人胃癌SGC-7901细胞均具有增殖抑制作用，其中SGC-7901细胞的凋亡是通过增加内质网应激，阻滞细胞S期，并激活Caspase信号通路实现的。

宫颈癌是妇科最常见的癌症之一，对大多数抗肿瘤药物不敏感，化疗有效率低，发病率居女性生殖系统肿瘤的首位。本研究以金蝉花为原料，制备了50%和80%两种浓度的醇沉金蝉花多糖，探讨醇沉金蝉花多糖体外抗人宫颈癌Hela细胞活性及可能的机制，以期为金蝉花抗肿瘤药品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

野生金蝉花于2018年7月采自江苏省句容市天王镇磨盘山，由江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定；牛血清白蛋白(上海蓝季科技发展有限公司)；考马斯亮蓝、葡萄糖、5-氟尿嘧啶(上海国药集团化学试剂有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司) ；高糖DMEM培养基(以色列Biological Industries公司)；兔抗人BAX、BCL2、P53单克隆抗体(美国CST公司)；β-肌动蛋白抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；羊抗兔二抗(南通碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Trizol总RNA提取试剂盒(徐州溥博生物科技有限公司)；0.25%胰酶消化液(上海创赛科技有限公司)；脱脂奶粉(澳大利亚迈高乳业有限公司)；苯酚、硫酸、95%乙醇、磷酸、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯。人宫颈癌Hela细胞(CBP60232)购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.2 仪器

B-490旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司)；RO-MB-10D高纯水机(浙江杭州永洁达膜分离设备厂)；高速低温离心机(美国Beckman公司)；SpectraMax190酶标仪(美国Molecular Devices公司)；倒置显微镜TS100(日本Nikon公司)；核酸蛋白检测仪(日本岛津公司)；基因扩增仪2720型(美国应用生物系统公司)；荧光定量PCR仪LightCycle96(瑞士罗氏公司)。

1.3 两种浓度醇沉金蝉花多糖的制备

将金蝉花去泥，粉碎，过80目筛。取50 g干燥粉末于1 L圆底烧瓶中，加入500 mL去离子水，88 ℃水浴加热，提取2次，每次2 h。3 990 r/min离心15 min，分离滤渣与滤液，合并两次滤液，旋转减压浓缩至70 mL。活性炭脱色3次，获得金蝉花多糖。然后将获得的多糖配置成5%的溶液，加入1/3体积的Sevage试剂(V三氯甲烷∶V正丁醇=4 ∶1)，充分振摇20 min，4 000 r/min离心15 min，脱蛋白4次，取少量上清液测定蛋白质及多糖含量，剩余上清液分别加入乙醇使其浓度为50%和80%，4 ℃静置过夜以沉淀金蝉花多糖，冷冻干燥，获得CP50和CP80。金蝉花多糖含量的测定参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中的苯酚—硫酸法。采用考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量[16]。

1.4 CCK-8法检测金蝉花多糖处理后人宫颈癌Hela细胞的增殖

收集对数生长期的Hela细胞，计数并调整细胞密度为约5 × 104个/mL，每孔加100 μL于96孔板中。药物处理组分别加入不同浓度的CP50和CP80培养液(25，50，100，200，400，800，1 600 μg/mL)；阳性对照组用5-氟尿嘧啶(50 μg/mL)处理；对照组用培养基处理；空白组为不加细胞的培养基。设5个复孔，培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液避光培养4 h，用酶标仪在波长450 nm处测定光密度(D)值，并计算细胞存活率。细胞存活率=(实验组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。使用GraphPad Prism软件计算半数抑制浓度(IC50)，筛选活性较好的多糖进行后续实验。

1.5 显微镜观察金蝉花多糖处理后Hela细胞的形态

将对数生长期的Hela细胞稀释成1 × 105个/mL的细胞悬浮液，并接种于24孔培养板中，每孔500 μL，培养24 h，除去培养基，PBS清洗2次，加入CP80多糖各样液(50、100、200、400、800 μg/mL)，对照组用培养基处理，阳性对照组加入5-氟尿嘧啶(50 μg/mL)，培养24 h，于显微镜下观察细胞形态。

1.6 DCFH-DA探针法检测金蝉花多糖处理后Hela细胞内活性氧水平

将Hela细胞(5×104个/mL)加入96孔板中，每孔100 μL，培养24 h，加入不同浓度的CP80培养基，24 h后吸除培养基，用PBS漂洗3次，加DCFH-DA溶液于培养箱内孵育20 min，用无血清培养基洗涤3次。使用荧光酶标仪检测荧光强度(激发光波长488 nm，发射光波长525 nm)，计数并计算DCF荧光强度/104个细胞。

1.7 实时定量PCR检测金蝉花多糖处理后Hela细胞P53、BAX和BCL2 mRNA表达

使用60 mm培养皿培养Hela 24 h，加入不同浓度的CP80培养基继续培养24 h。除去CP80培养基，用PBS洗涤2遍，按照Trizol提取试剂盒说明书提取Hela细胞总RNA，取1 μL测浓度，-80 ℃保存。按cDNA逆转录试剂盒说明书进行操作，于PCR仪中在42 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min的条件下合成cDNA。RT-PCR反应体系：Master Mix 9 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA模板各2 μL，加无RNA酶去离子水至20 μL。以β-肌动蛋白作为内参基因，进行实时荧光定量PCR分析，实验平行3次。

实验反应条件如下，P53：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性3 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，反应42个循环。BAX：95 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，反应42个循环。BCL2：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，65 ℃延伸20 s，反应46个循环。实验数据采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。RT-PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列如下，P53：上游 5′-TTCCTGAAAACAACGTTCTGTC-3′，下游 5′-AACCATTGTTCAATATCGTCCG-3′；BAX：上游 5′-CGAACTGGACAGTAACATGGAG-3′，下游5′-CAGTTTGCTGGCAAAGTAGAAA-3′；BCL2：上游 5′-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3′，下游 5′-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3′；β-肌动蛋白：上游 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。

1.8 蛋白质印迹检测金蝉花多糖处理后Hela细胞P53、BAX和BCL2蛋白表达

取对数生长期细胞按1×106个/mL接种于培养皿中。培养24 h后，加入不同浓度的CP80培养基继续培养24 h，PBS洗涤2遍，加胰蛋白酶消化1 min，完全培养基终止消化，4 ℃，4 000 r/min离心10 min。加入含PMSF的细胞裂解液冰上裂解35 min，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清液，BCA法准确测定蛋白浓度。加入5×SDS蛋白上样缓冲液溶解，煮沸5 min，以β-肌动蛋白作为内参。

蛋白样品上样30 μg，以10%的分离胶和5%的浓缩胶进行凝胶电泳分离。浓缩胶：80 V 30 min；分离胶：110 V 70 min。在 80 V条件下转膜60 min；37 ℃封闭1 h，用一抗稀释液β-肌动蛋白(1 ∶1 500)，BCL2(1 ∶1 000)，BAX(1 ∶1 000)以及P53(1 ∶1 200)孵育2 h，用二抗稀释液(1 ∶1 000)孵育1 h，曝光仪曝光，记录成像结果。使用Image J软件分析蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 CP50和CP80的含量

CP50和CP80的粗多糖得率分别为2.69%、18.79%，多糖含量分别为2.11%、6.23%。

2.2 两种浓度醇沉金蝉花多糖对Hela细胞增殖的影响

CCK-8结果如图1和图2。随着浓度的增加，CP50和CP80对Hela细胞的增殖均有一定的抑制作用(F=44.47，P<0.01；F=74.65，P<0.01)。与对照组相比，CP80浓度为100 μg/mL时，Hela细胞的存活率为87.73%(P<0.05)。随着浓度的升高，细胞存活率降低。当浓度为200、400、800 μg/mL时具有显著性差异，细胞存活率分别为84.85%、71.58%和58.60%(P<0.01)，当浓度达到1 600 μg/mL时，细胞已经大量凋亡，存活率为34.40%(P<0.01)。而CP50在浓度400 μg/mL时，细胞存活率降低才具有统计学意义，为82.98%(P<0.05)，随着浓度的升高，其抑制细胞增殖的作用较CP80小。通过GraphPad Prism软件计算得到CP50和CP80对Hela细胞抑制的IC50值分别为1 203.0 μg/mL和778.9 μg/mL。因此，后续实验使用CP80对人宫颈癌Hela细胞进行处理。

*：P<0.05，#：P<0.01，与对照组比较

*：P<0.05，#：P<0.01，与对照组比较

2.3 CP80处理后Hela细胞的形态

由图3可见，对照组中细胞生长良好，细胞数目多且形态为正常的梭形；5-氟尿嘧啶阳性对照组中细胞数目相对较少，细胞皱缩成团，死细胞、细胞碎片较多；CP80多糖处理组中活细胞数量与对照组相比，随浓度的递增，细胞逐渐减少，细胞死亡数也增多。

图3 CP80处理后Hela细胞24 h的形态(×100)

2.4 CP80处理后Hela细胞内的活性氧水平

如图4所示，CP80处理Hela细胞24 h后，细胞荧光强度较对照组显著增强，且荧光强度随CP80浓度的升高而增加(F=131.105，P<0.01),当多糖浓度达800 μg/mL时，细胞荧光强度达最大值。

*：P<0.05，#：P<0.01，与对照组比较

2.5 CP80处理后Hela细胞内P53、BAX和BCL2的mRNA表达

实时定量PCR结果显示，与对照组相比，随着CP80多糖浓度的增加，Hela细胞中BCL2mRNA的表达水平逐渐降低(F=5.246，P<0.01)，而BAX、P53mRNA的表达水平逐渐升高(F=17.642，P<0.01；F=7.661，P<0.01)。当CP80多糖浓度达到800 μg/mL时，三者表达水平与阳性对照组相当。见图5。

2.6 CP80处理后Hela细胞P53、BAX和BCL2蛋白的表达

不同浓度CP80培养后，蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，CP80能明显降低Hela细胞中BCL2蛋白的表达(F=141.506，P<0.01)，BAX、P53蛋白在CP80多糖浓度分别达到200 μg/mL、100 μg/mL时，表达水平即明显升高(F=6.256，P<0.01；F=3.804，P<0.05)。见图6。

n=3；*：P<0.05，#：P<0.01，与对照组比较

*：P<0.05，#：P<0.01，与对照组比较

3 讨论

宫颈癌作为女性高发恶性肿瘤，发病率在女性妇科恶性肿瘤中居第1位，在女性恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌。部分恶性肿瘤可通过手术、化疗等治愈，但多数恶性肿瘤治疗无法达到预期效果。因此，寻找新的疗效好、安全低毒的抗肿瘤药仍是当今人类面临的难题之一。随着科研理念和技术的不断更新，越来越多的科研工作者开始研究中药及其活性成分的抗肿瘤活性。何蒙娇等[17]研究表明，白藜芦醇可以下调人宫颈癌Hela细胞hTERTmRNA 和蛋白表达水平，抑制Hela细胞端粒酶活性，且呈浓度依赖性。中药活性成分蛇床子素能显著抑制Hela-S3增殖，其机制可能是升高细胞内活性氧水平，下调BCL2、Survivin蛋白表达，上调 BAX、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3 蛋白表达[18]。

本研究采用CCK-8法检测CP50和CP80两种粗多糖对Hela细胞增殖的影响，结果显示随着多糖浓度升高，两种多糖对Hela细胞的增殖均有抑制作用，但CP80的抑制效果更为显著，其原因可能是CP80多糖含量较CP50高。

本研究结果显示CP80对Hela细胞的IC50值为778.9 μg/mL，该浓度剂量远大于西药使用剂量(阳性对照5-氟尿嘧啶为50 μg/mL)。据文献报道，金蝉花水提物对肝癌MHCC97H细胞的IC50值为500～1 000 μg/mL[14]，金蝉花乙醇提取物对人胃癌SGC-7901细胞的IC50值为400 μg/mL左右[15]。可能因为中药多糖粗提物一般含有较多的杂质，并且通常分子量很大，难以通过细胞膜作用于肿瘤细胞，无法达到非常理想的治疗效果。而有研究报道榕属植物pandurata H分离纯化的均相多糖作用于Hela细胞24 h和48 h后的IC50值分别为31.50和22.62 μg/mL[19]。板栗纯化多糖YCP-H对人肝癌HepG2细胞的IC50值为 0.08 μg/mL，在剂量为1 mg/mL时，抑制率接近 95%，接近于临床上紫杉醇对人体的正常使用浓度。此外该多糖对人非小细胞肺癌A549细胞的IC50值为17.1 μg/mL[20]。因此，后续可以对金蝉花粗多糖进行分离纯化，以进行更深入系统的研究。

细胞内活性氧水平升高会启动氧化应激反应，从而诱导肿瘤细胞凋亡[21]。本研究中，随着CP80浓度的增加，Hela细胞内活性氧水平显著增加。在细胞凋亡过程中，BAX蛋白与细胞膜透化作用密不可分。而BCL2作为细胞外膜上的抗凋亡蛋白，能够与BAX前体结合阻止细胞凋亡的发生[22]。冯嘉昆等[23]研究表明半夏提取物抑制髓系白血病、T淋巴细胞白血病细胞增殖的作用机制与其调节BAX/BCL2、Caspase-3蛋白表达有关。而改善BAX、BCL2蛋白的表达，有利于非小细胞肺癌患者的康复[24]。本研究中，CP80处理后Hela细胞P53、BAXmRNA和蛋白表达水平显著上调，BCL2mRNA和蛋白表达水平显著下调。以上结果表明，金蝉花多糖抑制人宫颈癌Hela细胞的机制可能是通过提高细胞内活性氧，调控BAX/BCL2的基因及蛋白质表达，同时激活P53信号通路，介导Hela细胞凋亡。

综上，本研究以人宫颈癌Hela细胞为肿瘤研究模型，探讨了金蝉花粗多糖CP50和CP80的抗肿瘤活性作用，并对其机制进行了初步研究。后续将对CP50和CP80进一步分离纯化以进行更深入的研究，为金蝉花多糖开发应用于肿瘤的临床治疗提供有利的实验数据。