柴桂枣安汤对失眠模型大鼠的治疗作用及其机制

胡春艳，郭齐，刘港，刘雪玲，查心仪，高雨欣，周睿晨，陆素琴

(1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.镇江市中医院脑病科，江苏 镇江 212003)

失眠是一种常见的临床睡眠障碍疾病，主要表现为难以启动或维持睡眠[1]。长期失眠不仅会带来严重的精神心理负担，还会引起机体抵抗力、注意力、记忆力等下降，且会增加患者心脑血管事件发生率[2-3]。目前，西医临床仍以药物治疗为主，但一些传统的治疗药物存在不良反应多、药物依赖性等缺陷[4]。中医学中失眠症属于“不寐”范畴，中医药治疗失眠不良反应小，无成瘾性的优点使其受到越来越多的认同[5]。柴桂枣安汤为镇江市中医院陆素琴院长根据临床多年经验所得的经验方，是以桂枝汤、小柴胡汤、甘麦大枣汤为基本方加减而成，主要由川桂枝、醋柴胡、炒白芍、淡黄芩、法半夏、酸枣仁、生龙骨等组成。目前，临床研究表明柴桂枣安汤对肝胆气滞型失眠的治疗有显著作用，但是其相关的作用机制尚不清晰。因此，本研究采用对氯苯丙氨酸(p-Chlorophenylalanine，PCPA)建立失眠模型大鼠，观察其自发活动并分析血清生化指标，以初步探讨柴桂枣安汤改善睡眠的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂

雄性SPF级6周龄SD大鼠25只，体重(210.23±8.44)g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。适应性饲养1周。本研究遵从国际有关动物实验和临床研究的基本伦理和准则，并通过江苏大学动物伦理委员会批准。

柴桂枣安汤由镇江市中医院提供，组成：川桂枝9 g、醋柴胡20 g、炒白芍12 g、淡黄芩6 g、法半夏15 g、酸枣仁30 g、生龙骨30 g (先下)、生牡蛎30 g (先下)、制远志15 g、合欢皮30 g、夏枯草10 g、川厚朴10 g、茯苓神30 g、夜交藤30 g、淮小麦30 g、炙甘草6 g、红枣10 g、生姜6 g。

Bcl-2、 Bax、IL-2、IL-6、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) ELISA检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 将25只大鼠随机均分成 5 组，即正常组，模型组，阳性药组，柴桂枣安汤高、低剂量组，每组5只。除正常组外，各组于每天8:00-9:00腹腔注射350 mg/kg的PCPA，按1 mL/100 g体重给药，正常组给予等体积生理盐水，连续注射3 d。观察大鼠行为，出现昼夜节律消失表明模型制备成功。造模成功后第1天，柴桂枣安汤高(30 g/kg)、低剂量组(15 g/kg)，阳性药组(地西泮1 g/kg)，按照1 mL/100 g体重灌胃给药，正常组与模型组给予等体积生理盐水，连续灌胃7 d。

1.2.2 大鼠自发活动实验 造模成功后将大鼠置于干净的饲养笼中提前适应3 min，记录各组大鼠2 min内自主活动时间和前肢离地举立次数作为正常活动反应指标。末次给药后1 h再次测量各组大鼠上述指标。

1.2.3 血清生化指标分析 大鼠采用10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血8～10 mL，未抗凝；4 ℃凝固60 min；4 ℃，3 500 r/min离心15 min，取血清；于-80 ℃冰箱保存待测。按试剂盒说明书进行操作，检测BDNF、Bcl-2、Bax、IL-2、IL-6、GFAP含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 柴桂枣安汤抑制失眠模型大鼠的自主活动

给药前，模型组较正常组活动时间延长且站立次数显著增加(P<0.05)，说明失眠模型建立成功。给药后，阳性药组、柴桂枣安汤高剂量组及低剂量组活动时间较给药前明显缩短(P<0.05)，阳性药组、柴桂枣安高剂量组站立次数较给药前明显减少(P<0.05)，说明柴桂枣安汤能抑制失眠大鼠的自主活动。见表1。

表1 柴桂枣安汤对大鼠活动时间及站立次数的影响

2.2 柴桂枣安汤对大鼠血清BDNF及GFAP含量的影响

与正常组比较，模型组血清中BDNF含量显著降低(P<0.05)，GFAP含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药组和柴桂枣安汤高剂量组血清中BDNF含量显著升高(P<0.05)，GFAP含量显著降低(P<0.05)，柴桂枣安汤低剂量组GFAP含量显著降低(P<0.05)，BDNF含量有所升高但差异无统计学意义(P>0.05)；与柴桂枣安汤低剂量组相较，柴桂枣安汤高剂量组血清BDNF含量明显升高，GFAP含量明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清BDNF及GFAP含量比较

2.3 柴桂枣安汤对大鼠血清细胞因子含量的影响

与正常组比较，模型组血清中IL-6与IL-2含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性药组、柴桂枣安汤高剂量组及低剂量组大鼠血清中IL-6与IL-2水平显著升高(P<0.05)；与柴桂枣安汤高剂量组比较，柴桂枣安汤低剂量组IL-6含量明显升高(P<0.05)，IL-2含量明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清细胞因子含量比较

2.4 柴桂枣安汤对大鼠血清凋亡相关因子含量的影响

与正常组比较，模型组血清中Bcl-2含量与Bcl-2/Bax比值显著降低，Bax含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性药组、柴桂枣安汤高剂量组及低剂量组大鼠血清中Bcl-2含量及Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05)，Bax含量无显著性差异。柴桂枣安汤高剂量组血清Bcl-2含量与Bcl-2/Bax比值较柴桂枣安汤低剂量组显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清凋亡相关因子含量比较

3 讨论

失眠是指患者对睡眠时间或质量不满且影响白天社会功能的一种主观体验，是一种常见的睡眠障碍疾病[6]。其发病机制复杂，由身体因素及精神因素多方面影响，所以病程长且迁延不愈[7]。中医学认为正常的睡眠依赖于“阴平阳秘”。若阴阳失交，则发为不寐[8]。该病病位在心，与肝脾胃肾密切相关。中医药可调整人体脏腑气血的功能，改善患者睡眠状况，且不会产生药物依赖和严重的毒副作用，广泛用于临床[9]。本研究结果显示，用柴桂枣安汤干预失眠模型大鼠后，大鼠的活动时间缩短且站立次数减少，说明柴桂枣安汤能有效抑制失眠大鼠的自主活动，改善其失眠症状。本实验采用高、低两个剂量对PCPA所致失眠模型大鼠进行干预，均对大鼠的失眠症状具有改善作用。

目前认为失眠的主要发病机制包括中枢神经递质分泌的失调、γ-氨基丁酸能神经元系统功能受到抑制、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进、褪黑素分泌水平下降以及细胞因子分泌失调等[10]。神经营养因子参与神经元存活、生长并维持海马结构，受损的神经元在其存在的情况下具有再生的能力[11]。BDNF是神经营养因子家族的重要成员，广泛存在于中枢神经系统中，具有促进神经细胞生长发育，防止神经细胞损伤的功能。另外，BDNF还可参与调节睡眠—觉醒稳态[12]。本研究结果显示，柴桂枣安汤能有效升高失眠模型大鼠血清中BDNF含量，且高剂量组较低剂量组升高更为显著，说明柴桂枣安汤干预失眠的机制可能与BDNF含量升高有关，且具有剂量依赖性。GFAP在中枢神经系统中具有调节神经系统发育，神经元的损伤、修复、再生和可塑性等作用[13]。GFAP为星形胶质细胞活化的标志物，其含量增高代表星形胶质细胞活化增加，神经元处于应激损伤状态。星形胶质细胞能直接或活化后通过调控分泌多种细胞因子间接参与睡眠调控。本研究结果显示，给予柴桂枣安汤干预后，失眠模型大鼠血清中GFAP含量显著降低，且高剂量组较低剂量组降低更为显著，说明柴桂枣安汤干预失眠的机制可能与抑制星形胶质细胞增生活化有关，并且其对GFAP含量的降低作用具有剂量依赖性。细胞因子在神经-内分泌-免疫系统维持机体稳态中起重要作用。其中，IL-2能通过抑制脂质过氧化及升高Bcl-2基因表达从而抑制神经细胞凋亡[14]。IL-6与其受体结合后能与gp130结合形成二聚体从而发挥抗凋亡作用[15]。有研究表明IL-2、IL-6也可参与调节睡眠—觉醒稳态[16-17]。本研究结果显示，柴桂枣安汤能有效提高失眠模型大鼠血清中与失眠相关细胞因子IL-2及IL-6含量，且高剂量组较低剂量组IL-2变化更为显著，说明柴桂枣安汤可通过调节细胞因子IL-2及IL-6含量来干预失眠，并且对IL-2的调节呈剂量依赖性。细胞凋亡是一个由多基因控制细胞主动死亡的过程,主要受促凋亡基因和抑凋亡基因共同调节。Bcl-2蛋白可抑制细胞凋亡,而Bax可与Bcl-2结合，阻止Bcl-2激活，加速凋亡过程。既往研究表明，Bcl-2/Bax降低可能与睡眠剥夺有关[18-19]。本研究结果显示，柴桂枣安汤能显著升高失眠模型大鼠血清中Bcl-2含量，但对Bax含量无显著影响，说明柴桂枣安汤主要通过调节血清中Bcl-2含量来调节Bcl-2/Bax比值。此外,给予柴桂枣安汤干预后失眠模型大鼠血清中Bcl-2/Bax比值有明显的升高，且高剂量组较低剂量组升高更为显著，说明柴桂枣安汤干预失眠的机制与调节凋亡相关因子Bcl-2/Bax有关，并且呈剂量依赖性。

本研究运用柴桂枣安汤干预腹腔注射PCPA致失眠大鼠，发现柴桂枣安汤干预失眠的机制可能与调节神经保护因子BDNF水平，凋亡相关因子Bcl-2、Bax和细胞因子IL-2、IL-6水平，抑制星形胶质细胞增生、活化有关。