优化青花椒多酚提取工艺及多酚成分测定和抗氧化性研究

郭彩慧，朱毅*，马雪颖，邵萌萌，于梦淇，王永刚

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100089；2.解放军总医院，北京 100039)

花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc)属于芸香科，是一种常见的香料和油料作物，富含多种生物活性成分[1]，且具有较强的抗氧化能力，生活中还可用于抗菌、止痛等[2]。花椒有青、红两种颜色，青花椒主要产于南方，而红花椒在北方居多。两种花椒除外观上有较大差异外，在风味和组分方面也有一定差别[3-4]。本实验选用青花椒进行实验，相较于红花椒，青花椒个头更大，麻味更浓。如今，花椒的选种和栽培已取得较大的进展，但在深加工产业技术方面有所欠缺，需进一步研究[5-7]。

植物多酚，又称植物单宁，具有很强的抗氧化能力和抗菌活性[8-9]，可以减少细胞和组织中的氧化损伤[10]，因此可以作为天然抗氧化剂应用在不同领域中[11]。目前国内对植物多酚的提取和抗氧化性的研究臻于完善，花椒多酚的相关研究也多基于红花椒，但是对于青花椒多酚的研究未见报道，因此，本实验选用优质青花椒为实验原料，利用有机溶剂浸提法提取多酚类物质，研究A，B，C，D 4个因素对花椒多酚提取率的影响，采用正交实验优化花椒多酚的提取条件；采用柱层分析法纯化青花椒多酚粗提液，进行成分和抗氧化能力测定。花椒被广泛用作调味品，但在其他方面应用较少，所以本文旨在增加花椒的综合利用，为花椒深加工技术的发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青花椒：鲁甸县明德农业开发有限公司。将青花椒在45 ℃下干燥24 h，用粉碎机粉碎成花椒粉，常温避光储藏。

抗坏血酸(Vc)、福林酚、2,2-联苯基-1-苦基肼基、2,2′-联氨-双二胺盐：北京索莱宝科技有限公司；过硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、槲皮素、表儿茶素、山奈酚、阿魏酸、表儿茶素没食子酸酯：北京世纪奥科生物技术有限公司；以上试剂均为标准品。聚酰胺粉(规格100～200目)：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZBRTD-211数显恒温水浴锅；UV5300紫外可见分光光度计；SHB循环水式多用真空泵；BYB-300A高速多功能粉碎机；XMTD-8222电热恒温水槽；RE-2000A旋转蒸发仪；FD-1B-50冷冻干燥机；BT-200B数显恒流泵；2XZ(S)-2旋片式真空泵：以上仪器均为国产；5430R冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法与内容

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

将0.1 g没食子酸溶于蒸馏水中，定容至100 mL，得1.0 mg/mL的没食子酸溶液，50 mL容量瓶中分别移入0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mL，加25 mL蒸馏水和2 mL Folin-Ciocalteu试剂，混合均匀后静置4～5 min，加入4 mL 10% Na2CO3试剂并用少量蒸馏水稀释，在30 ℃下恒温水浴2 h，在765 nm处测量样品的吸光值[12-14]，绘制样品标准吸光曲线。

1.3.2 青花椒多酚的提取及测定

将2.00 g花椒粉溶解在60%的乙醇中，料液比为1∶20 (g/mL)，40 ℃下恒温水浴60 min,在7000 r/min、4 ℃下离心20 min。将提取物在50 ℃下浓缩至25%，以便从花椒中获得多酚的粗提取物。按1.3.1方法测量吸光度后，根据下式计算多酚含量[15]：

W=C×V×N/M×1000。

式中：W为多酚含量(mg/g);C为没食子酸的浓度(μg/mL);V为粗提液的体积(mL);N为稀释的倍数;M为取样量(g)。

1.3.3 青花椒多酚提取单因素实验[16]

根据1.3.2的方法，将乙醇提取青花椒多酚浓度(20%、30%、40%、60%、80%)、提取温度(30，40，50，60，70 ℃)、提取时间(30，50，60，70，90 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)作为单因素条件，探究其对青花椒多酚提取量的影响，每组实验重复3次。

1.3.4 青花椒多酚的分离纯化[17-19]

取适量的聚酰胺粉溶于95%的乙醇溶液，反复搅拌直至除去白色气泡后倒入装柱，用95%乙醇洗脱，洗脱液透明后用5% NaOH、蒸馏水、10%醋酸洗脱，最后用蒸馏水洗脱至中性。将浓缩的青花椒多酚粗提液(1.5 BV)进行上样，保留30 min，分别用蒸馏水(1.5 BV)、70%乙醇洗脱，收集2，3 BV洗脱液，用真空旋转蒸发仪浓缩后得到青花椒多酚纯化物。

1.3.5 高效液相色谱法测定青花椒多酚成分[20-23]

1.3.5.1 供试品溶液的准备

用色谱级甲醇溶解1 mg青花椒多酚纯化物，得到1 mg/mL的样品溶液，用0.45 μm微孔滤膜进行过滤后置于棕色进样瓶中。

1.3.5.2 标准品溶液的准备

分别称量儿茶素等10种标准品20 mg，溶解于色谱级甲醇中，得1 mg/mL的标准品溶液，保存在棕色容量瓶中，随后将其配制成浓度为1，5，10，20，40，60 μg/mL的混合标准溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤后置于一个棕色进样瓶中。

1.3.5.3 色谱条件

色谱柱：Inert Sustain C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：色谱甲醇，柱温：40 ℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：280 nm，检测器：Agilent 1200，DAD检测器。

HPLC色谱梯度洗脱条件见表1。

表1 HPLC色谱梯度洗脱条件Table 1 The gradient elution conditions of HPLC

1.3.6 青花椒多酚与Vc对DPPH、ABTS+自由基的清除作用

用无水乙醇分别溶解10 mg的青花椒多酚粗提物、纯化物和Vc，定容至10 mL，保存到棕色容量瓶中，浓度为1 mg/mL，用无水乙醇分别稀释，得到浓度为0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.10，0.20，0.40 mg/mL的样品溶液[24]。取2 mL DPPH乙醇溶液和2 mL样品溶液混合，并在常温、黑暗条件下保存30 min，测量517 nm处的吸光度，并使用无水乙醇作为对照和空白；将4.0 mL ABTS+测定液和0.4 mL样品溶液混合，振荡30 s后静置5 min，在734 nm处测量吸光度，无水乙醇溶液作为对照和空白。

DPPH 自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

公式(1)

式中：Ai为吸光值(2 mL DPPH+2 mL样品溶液)；Aj为吸光值(2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液)；A0为吸光值(2 mL DPPH+2 mL无水乙醇)。

ABTS+自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100%。

公式(2)

式中：A1为吸光值(4.0 mL ABTS+测定液+0.4 mL样品溶液)；A0为吸光值(4.0 mL ABTS+测定液+0.4 mL无水乙醇)。

1.3.7 数据统计与分析

数据使用SPSS 25.0进行分析，Origin 9.0进行作图，结果用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 青花椒多酚提取单因素实验结果

2.1.1 没食子酸标准曲线

图1 没食子酸标准曲线

横坐标为没食子酸浓度，纵坐标为765 nm处的吸光度，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.1027x+0.0151，R2=0.9981。

2.1.2 单因素实验结果

由图2中(a)可知，青花椒多酚含量随着提取温度的升高呈先上升后下降的趋势，60 ℃时达到峰值，较高的加工温度提高了细胞壁的渗透性，如果适当地升高温度，则原料中的蛋白质可以被固化，且酶可以被破坏以增加提取溶液的稳定性，从而使多酚的提取量增加[25-27]；但是温度过高，一些耐热的活性成分反而会被破坏，同时引起多酚类物质发生氧化反应及聚合反应，其分子结构受到影响，同时容易引起溶剂蒸发损失和其他组分的溶解度增加，多酚提取量下降[28-29]。因此，提取温度为60 ℃最适宜。

图2 温度、时间、料液比、乙醇浓度对青花椒多酚提取量的影响Fig.2 Effects of temperature, time, solid-liquid ratio, ethanol concentration on the extraction amount of polyphenols from Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc

由图2中(b)可知，在多酚提取的初始阶段，多酚提取含量增加较快。提取时间在30～60 min阶段变化时，曲线的斜率较大，当时间达到60 min时，多酚提取含量最高，随后逐渐减小，最后多酚含量的增加率趋于平稳，原因可能是提取时间越长，提取物和被提取物的作用时间越长，有利于多酚的释放，但时间过长时，由于缺乏稳定的多酚，在萃取过程中氧气会进入，会导致多酚的氧化分解，多酚的提取量降低[30]。因此，选取最优提取时间为60 min。

由图2中(c)可知，随着乙醇用量的增加，青花椒多酚提取含量先快速升高后趋于平缓，料液比为1∶10～1∶30时，多酚提取速度增加较快，料液比为1∶30～1∶50时，多酚提取量的增速逐渐缓慢，这是因为多酚类物质会通过氢键、疏水键结合其他物质，而有机溶剂可以破坏这些结合键，因而在一定范围内，可通过增加溶剂量来促进多酚的溶解[31]。但基于降低实验成本等角度的考虑，有机溶剂乙醇用量不宜过多，选取1∶30为最适宜的料液比。

由图2中(d)可知，随着乙醇浓度的增加，青花椒多酚提取含量呈先升高后下降的趋势，乙醇浓度达到40%时提取含量最高，之后明显下降。当溶剂浓度低时，极性强，导致水溶性物质(如糖)的浸出增加，糖和多酚结合降低了多酚提取量，从而影响了多酚的提取。根据相似相溶原理，随着乙醇浓度的增加，多酚和乙醇的极性越来越近，使多酚的提取量增加，但乙醇浓度过高可使组织中蛋白质变性，而且乙醇浓度过高更加容易挥发，这些都影响多酚类物质的提取效果[32]。考虑到环保问题，选取40%为最适宜的乙醇浓度。

2.2 正交实验因素水平设计

通过单因素实验，比较了4种不同水平的因素对青花椒多酚提取率的影响，选取最适提取条件，设计了四因素三水平的正交实验，见表2。

表2 正交实验因素水平设计Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2.3 青花椒多酚提取工艺正交实验设计结果分析

设计L9(34)正交实验，通过比较K值和R值，得出各因素对青花椒多酚提取率的影响程度为D>C>B>A；结合表2和表3和图2可知，最佳因素水平组合为A1B2C2D2；由表4可知，正交实验中的A，B，C，D 4个因素对青椒多酚提取率的影响并不显著。因此，不再在每个因子级别之间进行多次比较。

表3 正交实验方案及结果Table 3 Orthogonal experiment scheme and results

表4 正交实验结果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.4 青花椒多酚成分测定结果

对应图3标准品的出峰时间，检测出图4青花椒多酚纯化物样品中共含有5种成分：表儿茶素、槲皮素、对香豆酸、山奈酚、阿魏酸，分别将这5种成分在1，5，10，20，40，60 μg/mL浓度下建立标准曲线，根据线性回归方程得出青花椒多酚纯化物成分含量检测结果，见表5。

图3 混合标准品HPLC图

图4 青花椒多酚纯化物HPLC图

表5 青花椒多酚成分检测结果Table 5 The determination results of polyphenols from Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc

2.5 青花椒多酚抗氧化性测定

由图5和图6可知，青花椒多酚DPPH、ABTS+自由基清除能力较强，不难看出青花椒多酚对ABTS+自由基清除能力优于DPPH自由基，当浓度为0.2 mg/mL时，VC、青花椒多酚纯化物和青花椒多酚粗提物DPPH自由基清除率分别为93.34%、91.76%、88.11%，ABTS+自由基清除率分别为100%、97.39%、81.47%。无论是青花椒多酚纯化物还是粗提物，它们的DPPH自由基清除率略低于Vc，但是，纯化物的ABTS+自由基清除率达到97.39%，接近Vc的清除效果；在浓度为0.40 mg/mL时，青花椒多酚纯化物的清除率高达99.90%，近似等同于Vc的清除效果，粗提物的清除率为96.91%，接近纯化物的清除效果。由此可知，青花椒多酚具有很强的抗氧化能力，并且具有清除ABTS+自由基的强大能力。同样有研究表明，青、红花椒提取物抗氧化作用存在差异，其中青花椒提取物脂质过氧化的抑制能力较强，红花椒提取物DPPH自由基清除率较高。

图5 不同样品对DPPH自由基的清除率

图6 不同样品对ABTS+自由基的清除率

3 结论

由单因素实验结果可知，乙醇浓度对青花椒多酚提取率的影响程度最大，接着是料液比提取时间和温度，正交实验得到青花椒多酚的最佳提取工艺：温度55 ℃，提取时间60 min，料液比1∶30 (g/mL)，乙醇浓度40%，得率0.097%。在抗氧化实验中，DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力依次为Vc>纯青椒多酚>粗青椒多酚提取物，随着样品浓度的增加，青花椒多酚的DPPH自由基清除能力始终略低于Vc，但青花椒多酚对ABTS+自由基清除能力与Vc相当，甚至有超过Vc的趋势，这表明青花椒多酚的ABTS+自由基清除能力较强。总之，研究表明青花椒多酚具有很强的抗氧化能力，这说明青花椒多酚具有作为天然抗氧化剂的潜力，以便在各领域中得到应用。