基于PCR-DGGE技术对糍粑辣椒腐败过程细菌多样性动态研究

吴昭庆，胡萍*，程华，杨欣

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵州省长顺黔南山绿色食品有限公司，贵州 黔南布依族苗族自治州 550700；3.贵州省安顺职业技术学院，贵州 安顺 561000)

贵州辣椒资源丰富，营养价值高，是一种重要的药食同源蔬菜[1-2]。糍粑辣椒作为贵州独具一格的地方特色辣椒制品，选用干红辣椒、姜、蒜等为原料，经高温煮制、镭砵捣碎而得，是贵州特色辣子鸡和油辣椒等家常菜肴的特色佐料，具有色泽鲜艳、味道鲜美、风味独特等特点[3]。

糍粑辣椒水分含量较高，即使在冰箱中冷藏保鲜，其保质期也不超过1周，所以出现了产品难以保存、不易贮藏、保质期短的技术难题。目前对糍粑辣椒的研究鲜有报道[4-5]，对糍粑辣椒中腐败微生物及致腐机理更是不清楚，为了采取有针对性的措施延长产品的保质期，必须掌握糍粑辣椒的优势腐败菌及其生长影响因素。

PCR-DGGE技术可较为全面地体现样品微生物的多样性及细菌群落结构的动态变化，该技术也被广泛应用于食品中微生物菌相的变化分析[6-11]，在由微生物所引起的食品腐败变质方面提供了较大的技术支撑[12-14]。丁文等[15]采用传统培养和非培养(PCR-DGGE)比较的方法对热处理辣椒酱中的残留微生物情况进行了研究，得出采用传统培养法不易对某些相对丰度较低的微生物菌株进行分离，采用PCR-DGGE 技术则可更全面准确地反映辣椒酱中微生物种类的多样性。因此，本研究基于PCR-DGGE技术对糍粑辣椒腐败过程中细菌群落微生物进行动态变化监控分析，明确其中的优势腐败菌群及腐败特点，为后续如何利用适当的保鲜技术、有效的杀菌方式，有针对性地抑制糍粑辣椒腐败微生物的生长，为提高贵州糍粑辣椒制品的质量稳定安全性和延长货架期提供一定的科学理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：取自贵州省黔南山绿色食品有限公司，新鲜生产未作任何处理的糍粑辣椒样品(约500 g)，样品采集完成后，立即送到实验室进行0～7 d的DNA提取及相关理化指标的测定。

1.2 实验试剂

溶菌酶、去离子甲酰胺、TE缓冲液(8.0)、Tris-平衡酚：北京索莱宝科技有限公司；溴化乙锭(ethidium bromide, EB)：美国Sigma公司；PCR引物：上海捷瑞生物技术有限公司；GoTaq®Green Master Mix：美国Promega公司；无水乙醇：重庆川东化工有限公司；实验所用其他有机、无机试剂：均为分析纯，市售。

1.3 主要仪器设备

Micro 17R微量高速冷冻离心机 美国 Thermo Electron公司；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；涡旋振荡器、混合机 江苏省海门市麒麟医用仪器厂；立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；Gel Doc XR凝胶成像系统、PCR仪 美国BIO-RAD公司；超纯水仪 上海市和泰仪器有限公司；电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；快速水分测定仪 深圳冠亚水分仪科技有限公司；便携式pH计 深圳德图仪表有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细菌总DNA的提取

参照臧凯丽等、樊敏等[16-17]的方法，准确称取10 g糍粑辣椒样品放入250 mL三角瓶中，加入磷酸盐缓冲液(137 mmol/L NaCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, 2.7 mmol/L KCl) ，用4层无菌纱布过滤粗渣，收集无渣滤液，用移液枪吸取至2 mL离心管中，10000×g离心6 min，倒掉清液，富集沉淀,若沉淀量少，可重复2～3次，然后加400 μL溶菌酶 (质量浓度50 mg/mL)，在37 ℃条件下进行1 h的水浴(每隔20 min摇匀一次)；水浴后加入200 μL的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)(10%)，在60 ℃条件下进行20 min的水浴；水浴后先加入100 μL 5 mol/L NaCl，再加入600 μL十六烷基三甲基溴化铵 (hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)，在65 ℃条件下进行15 min的水浴，然后将水浴后的混合溶液12000×g离心6 min，用移液枪吸取上清液与等体积的Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1溶液混匀，12000×g离心5 min；吸取上清液至新的离心管，与等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1溶液混匀，12000×g离心5 min；吸取上清液至新的离心管，加入2倍体积分数为30%聚乙二醇和3 mol/L 1/8体积NaCl，于4 ℃条件下放置3 h后取出于12000×g离心10 min，倒掉上清液，吸取200 μL冰乙醇洗涤，加60 μL TE缓冲液置于-20 ℃条件下保存备用。

1.4.2 感官评定标准

参照《贵州糍粑辣椒制作工艺》稍作修改。

1.4.3 菌落总数的测定

参照《微生物学试验教程》[18]。

1.4.4 Aw值的测定

参照GB 5009.3-2010《食品中水分的测定》。

1.4.5 pH值的测定

参照GB/T 10468-1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》[19]。

1.4.6 总酸含量的测定

参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[20]。

1.4.7 PCR扩增

1.4.7.1 第1轮PCR扩增(巢式PCR)

采用27F[21](AGA GTT TGA TCC CTC AG)和1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)通用引物对细菌进行16S rDNA全长扩增。反应总体系(25 μL)：DNA模板2 μL，引物(1 μmol/L)各2 μL，Go Taq®Green Master Mix(2X)12 μL，灭菌dd H2O 6 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，58.5 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min,共25个循环；最终72 ℃延伸2 min。

1.4.7.2 第2 轮PCR扩增(降式PCR)

以2 μL第1轮PCR产物为模板DNA，采用引物GC-338F(GC-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)扩增，反应总体系25 μL(同上)。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，退火温度从67.5 ℃降至57.5 ℃，每个循环降低0.5 ℃，退火时间是3 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；恒定退火温度下进行94 ℃变性1 min， 57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共10个循环。

1.4.7.3 第3轮PCR 扩增(Reconditioning PCR)

以2 μL第2轮PCR产物为模板DNA，采用引物338F(ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)进行Reconditioning PCR扩增。反应总体系25 μL(同上)，PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，为5个循环；最终72 ℃延伸5 min。

PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4.8 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

对样品细菌16S rDNA V3区扩增产物进行DGGE电泳。参照胡萍[22]的条件稍作改动：8%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度范围35%～65%(其中100%变性剂含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)；上样后在0.5×TAE缓冲液(TAE缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成)中200 V预电泳10 min，然后85 V电泳16 h，EB染色后置于凝胶成像仪，在系统内拍照，采用Quantity One (Bio-Rad)分析软件进行图像分析。

1.4.9 条带回收及测序

在无菌操作下，用无菌刀片将DGGE胶上不同位置的条带切下，放入2 mL离心管中，捣碎后加入20 μL ddH2O，于4 ℃过夜。吸取2 μL为模板DNA对16S rDNA V3可变区域进行扩增(条件同1.4.7.2)。将PCR产物经过DGGE证明和所割条带在相同迁移位置后再割胶回收,使用引物(不含GC夹子)对16S rDNA V3的可变区再次进行扩增，将纯化后的PCR产物送到上海红生物工程技术公司进行测序。登录NCBI(nationalc enter of biotechnology information)中的GenBank数据库进行序列相似性比对。

1.4.10 数据处理

采用 Excel 2017对所得数据进行计算，Mega 7.0构建系统发育树，所有数据测定均重复3次，结果采用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 糍粑辣椒贮藏过程中的感官及理化品质

对0～7 d糍粑辣椒每隔24 h记录其感官品质，结果见表1。

表1 糍粑辣椒贮藏过程中的感官品质Table 1 The sensory quality of Ciba pepper during storage

由表1和表2可知，糍粑辣椒贮藏0～7 d过程中，感官品质随着贮藏时间的延长而逐渐下降，从第0天的色泽鲜艳呈亮棕红色，组织状态粘稠度好，呈泥状，气味浓郁，香味突出，愉悦有食欲，到第6天的色泽呈暗红色，组织状态粘稠度很差，质地稀薄，有略微酸腐异味这些腐败特征；水分活度值是决定食品腐败变质和保质期的重要参数，水分活度越小的食物越稳定，较少出现腐败变质现象，糍粑辣椒Aw值从第0天的(61.75±0.15)%到第6天的(59.61±0.12)%，呈下降趋势，但是糍粑辣椒总体Aw还是过高，说明Aw值给微生物提供了一个良好的生长环境，是导致糍粑辣椒腐败变质的一个重要因素；pH和菌落总数值是反映食品品质的重要指标，能够反映食品在贮藏过程中的微生物代谢和生长繁殖情况，总酸含量可以反映糍粑辣椒中酸味物质含量变化，会使糍粑辣椒产生酸腐味，从而可判定为已腐败变质，糍粑辣椒pH值从第0天的5.21±0.02降到第6天的4.67±0.04，总酸值也从第0天的(4.17±0.05) g/kg升高至第6天的(6.29±0.07) g/kg；菌落总数值从第0天的(3.25±0.05) lg CFU/g增加到第6天的(7.12±0.03) lg CFU/g，说明随着贮藏天数的增加，微生物大量生长繁殖，在酶和产酸菌的共同作用下产酸，从而导致pH值逐渐降低，总酸含量逐渐升高，产品品质急速下降，最终导致产品发生腐败变质。综上所述，通过对感官的评定和理化指标的测定得出本研究糍粑辣椒在第6天已达到肉眼可见的显著腐败。

表2 糍粑辣椒理化指标的测定Table 2 The detection of physical and chemical indexes of Ciba pepper

2.2 细菌PCR扩增结果

图1 PCR电泳结果

2.3 DGGE细菌图谱微生物多样性分析

糍粑辣椒样品0～7 d细菌总DNA的DGGE图谱见图2。

图2 样品贮藏过程细菌总DNA的DGGE图谱

采用2次重复检测验证每个取样点条带的方式，结果显示DGGE图谱皆无明显差异。DGGE图谱上条带的多少和亮度分别代表微生物种类的多少和数量的多少[23]，条带越多说明样品的菌种种类越丰富，条带越粗亮说明该种微生物数量多，占优势。图谱上不同迁移位置条带代表着不同种类的微生物，相同的迁移位置代表着相同的条带，同种微生物迁移位置相同，即为相同条带，反之，则称为差异性条带[24]。由DGGE图可以看出，在0～7 d糍粑辣椒贮藏动态监测过程中，检测出较多条带，也都比较亮，表明糍粑辣椒中微生物多样性较高，优势菌较突出。将DGGE图谱上不同的条带进行割胶、DNA回收、测序，登录NCBI网站在Blast软件中的GenBank数据库里进行序列比对，其分析结果见表3，条带8，12分别为潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、非培养的罗思河小杆菌属(UnculturedRhodanobactersp.)，相似性为93%、92%，其余条带检测出的细菌相似性则均达95%以上，其中，条带10，14分别为葱属洋葱菌(Alliumcepa)、阿里谷氨酸杆菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其相似性高达100%。

表3 DGGE条带细菌16S rDNA部分基因序列比对分析Table 3 The sequence analysis of bacterial 16S rDNA partial genes of DGGE bands

由图2和表3可知，糍粑辣椒在0～7 d的贮藏过程中,微生物多样性较高，有明显的差异动态演替性。共检测出14种不同种属的细菌:Leuconostoclactis，Klebsiellaoxytoca，Weissellasp.,Serratiasp.,Leclerciaadecarboxylata, UnculturedChroococcidiopsissp.,Pantoeacypripedii,Alliummonanthum,Arthrobactersp.,Paenarthrobacternitroguajacolicus,Glutamicibacterarilaitensis, UnculturedRhodanobactersp.,Alliumcepa和Alliumxichuanense。贮藏1 d时，糍粑辣椒微生物菌相较0 d时发生了明显的变化，条带显著增多，变亮，条带4，5，9，11，12显现且较亮，分别属于沙雷氏菌(Serratiasp.)、阿德莱斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、节杆菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、西川葱属(Alliumxichuanense)、非培养的罗思河小杆菌(UnculturedRhodanobactersp.)。贮藏2 d时，菌相又有不同变化，条带4，5，11，12消失，条带2，6，8，9明显变亮，分别属于产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、葱属菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、节杆菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)，直到贮藏第6天时，条带8，9完全消失，原因可能是样品贮藏时间过长，所在环境的不利影响和样品本身水分含量高，pH偏低，总酸升高，细菌大量增长繁殖，产生一系列的代谢产物，从而抑制了条带8，9的生长[25]。样品的贮藏过程就是样品的腐败过程，条带8，9是在样品贮藏过程中逐步出现最后在腐败终点时才消失的，这与Gram等[26]关于特定腐败菌(SSO)的理论相符：特定腐败菌在产品贮藏初期数量很少，仅占微生物群落的很少部分，但在产品腐败过程中逐渐占据主导地位。从DGGE图中可以看出，随着贮藏时间的延长，主要优势条带 6，7，10，13，14从样品初期0 d到整个腐败后期都一直存在，并且一直处于高浓度亮度，分别属于葱属菌(Alliummonanthum)、未培养的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、葱属洋葱菌(Alliumcepa)、关节杆菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸杆菌(Glutamicibacterarilaitensis)，不仅粗而且亮，在腐败过程中占据着绝对的优势主导地位，说明它也是糍粑辣椒的主要腐败菌，且还是糍粑辣椒贮藏过程中的优势腐败菌。因此，综上分析，可以确定糍粑辣椒的主要腐败菌群为葱属菌(Alliummonanthum)、未培养的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、葱属洋葱菌(Alliumcepa)、关节杆菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸杆菌(Glutamicibacterarilaitensis)，而潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、节杆菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)为糍粑辣椒贮藏过程中的优势腐败菌。

将细菌DGGE图谱上切割条带测序结果进行系统发育树的构建，结果见图3。

图3 菌株系统发育树

所得测序结果可以分为3个类别：类别Ⅰ为未培养的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、节杆菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、葱属洋葱菌(Alliumcepa)、非培养的罗思河小杆菌(UnculturedRhodanobactersp.)、阿德莱斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、西川葱属(Alliumxichuanense)、葱属菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、阿里谷氨酸杆菌(Glutamicibacterarilaitensis)，包含条带为7，9，10，12，5，11，6，8，14，类别Ⅱ为关节杆菌(Arthrobactersp.)，包含条带是13，类别Ⅲ是乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、魏斯氏菌(Weissellasp.)、沙雷氏菌(Serratiasp.)，包含条带为1，3，2，4。

3 结论

本研究基于PCR-DGGE技术对糍粑辣椒腐败过程中的细菌多样性进行动态分析，研究结果表明：样品贮藏0～7 d过程中，随着贮藏时间的延长，pH和Aw值呈下降趋势，菌落总数和总酸值则显著升高，感官评定呈逐渐降低趋势，综合分析得出在第6天达到肉眼可见的腐败终点。通过DGGE共检测出14种不同种属的细菌，从而确定糍粑辣椒腐败过程中的主要腐败菌群是葱属菌(Alliummonanthum)、未培养的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、葱属洋葱菌(Alliumcepa)、关节杆菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸杆菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其中，优势腐败菌则是潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、节杆菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)。本研究结果将为糍粑辣椒贮藏过程中微生物的腐败研究提供非常重要的生物学数据支撑，同时也为如何延长糍粑辣椒保质期技术的研究及采用针对性的抑制手段提供了强大的理论支撑。