黑茶茶汤中赭曲霉毒素A的提取与检测方法

闫航滨，赵维凡，汤梦婷，周 育

黑茶茶汤中赭曲霉毒素A的提取与检测方法

闫航滨，赵维凡，汤梦婷，周 育*

(安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室，合肥 230036)

日常饮茶中，茶叶若因加工或贮藏不当污染了一定量霉菌毒素，同时对于冲泡过程中的浸出率及实际的摄入量，仍欠缺深入了解。为建立茶汤中赭曲霉毒素A（OTA）的提取方法，为饮茶所摄入生物毒素的安全评估提供更合理的分析方法，研究使用乙腈作为提取溶剂提取茶汤中的OTA，然后加入盐离子使乙腈和水相分层，去除杂质后，以高效液相色谱法（HPLC）分析检测，通过对比4种不同方法的准确度、线性、精密度、灵敏度等指标，选择最合适于茶汤的检测方法。结果表明，方法M4通过用含0.1%甲酸酸化乙腈提取，用氯化钠和硫酸镁使乙腈和茶汤分层，在准确度、精密度、灵敏度等指标上，均优于其他3种方法。方法M4在茶汤中OTA添加浓度为1～45 µg·L-1时回收率为82.5%～99.8%，标准偏差为1.4%～7.3%；该方法添加回收的回归方程相关系数为0.9971。在日间和日内验证试验中，高浓度毒素组日内回收率为90.9%，相对标准偏差为2.2%，日间回收率为87.5%，相对标准偏差为3.2%；低浓度毒素组的日内回收率为91.9%，相对标准偏差为5.2%，日间回收率为92.4%，相对标准偏差为6.7%；该方法的定量限为1.1 µg·L-1，检出限为0.33 µg·L-1。不同类型黑茶茶汤验证实验发现，该方法的回收率均高于88.65%。对比这4种方法，方法M4在分析结果上均好于其他3种方法，适合用于茶汤中OTA的检测，该方法对于OTA在茶水冲泡过程中浸出情况及安全风险评估有重要的参考意义。

茶汤；赭曲霉毒素；方法建立；高效液相色谱；方法验证

茶叶因富含茶多酚、茶氨酸等多种生物活性成分并具有较好的保健功效深受人们的喜爱。饮茶在我国，甚至世界上很多国家已经成了一种健康的生活习惯[1-3]。后发酵黑茶加工过程离不开微生物参与，尤其在渥堆发酵过程中来源于鲜叶及环境中的菌群对黑茶品质及风味的形成有重要作用。然而，这些土著微生物菌群对茶叶风味形成具有重要贡献的同时是否存在有害微生物及霉菌毒素的污染，也是一个值得关注的问题。我国的茶叶加工企业具有数量多、规模小、生产质量良莠不齐等鲜明特征。在一些中小企业，生产过程中因环境卫生条件不适宜、渥堆发酵条件控制不当或者生产、销售过程中因贮藏条件不当等因素造成的有害微生物污染难以避免[4-5]。发酵茶叶为一类次生代谢产物含量丰富的基质，霉菌毒素污染问题并不像花生、大米和玉米（富含脂肪、淀粉和蛋白质）等农产品那样突出，但作为一种由自然发酵食品（饮品），其微生物的安全问题仍需要高度重视[6]。

赭曲霉毒素A（OTA）是食物中最常见的霉菌毒素之一，它是由几种曲霉菌（spp.）和青霉（spp.）产生[7]。有害霉菌的生长及毒素产生，取决于许多因素，包括菌株生长的温度、湿度、食品基质、含水量以及后续食品加工和储存环境等[8-9]。赭曲霉毒素A已被国际癌症研究机构列为2B类致癌物（即可能对人类有致癌），同时也具有神经毒性、肾毒性和免疫抑制作用[10]。研究显示，发酵茶在不适当的加工和贮藏环境有可能会有产毒曲霉和OTA的污染[11-15]。从现有的检测结果来看，各类霉菌毒素在茶叶中的检出率及阳性样品污染浓度呈“双低”特点。关于茶叶中霉菌毒素检测方法研究，主要集中于从干茶中直接提取霉菌毒素，并未考虑各类霉菌毒素水溶性和泡茶浸出率问题。然而，茶叶有别于其他食品基质，不直接食用。因此，研究茶汤中霉菌毒素的提取及检测方法，对研究不同类型霉菌毒素在茶叶冲泡过程中的提取率及膳食摄入水平具有重要意义。QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged和safe）是近年来发展的一种用于农药快速提取方法，其原理为样品经乙腈或酸化乙腈提取后，采用盐离子盐析分层，以PSA（乙二胺-N丙基硅烷）和PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）等试剂除去基质中有机酸、色素、酚类等干扰物，以达到净化目的[16-18]。本研究依据QuEChERS原理，对茶汤中OTA的不同提取方案进行对比分析，建立茶汤中OTA最佳分析方法，以期为茶叶中OTA的膳食风险监测、评估做技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑茶茶样：普洱熟茶（散茶）、六堡茶、安化黑茶、青砖茶、康砖茶和茯砖茶的茶样均采购自国内的茶叶专门店或网上专卖店，每种茶样收集均超过1.0 kg，常温保存于干燥环境中。

1.2 试剂与仪器

本试验主要试剂包括：色谱纯乙腈（纯度>99.9%，美国TEDIA公司）；色谱纯甲酸、乙酸（纯度>98.0%，上海阿拉丁公司）；蒸馏水（香港屈臣氏公司）；氯化钠（纯度> 99.0%）、硫酸镁（纯度>98.0%）、柠檬酸钠（纯度> 98.0%）均购买于上海生工生物公司；乙二胺-N丙基硅烷（PSA，纯度> 98.0%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP，纯度> 98.0%）均为德国CNW Technologies公司产品。赭曲霉毒素A标准品（20 µg·mL-1于甲醇，纯度> 99.0%）为美国维康公司产品。

主要仪器包括：涡旋震荡仪（德国依卡有限公司），微量移液器（德国Eppendorf公司），低温高速离心机（美国sigma公司），离心浓缩仪（上海般诺），高效液相色谱仪（美国waters公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶汤的准备 取5 g普洱（熟茶）茶样于500 mL锥形瓶中，加入250 mL沸水浸泡5 min，冷却至室温，随后用玻璃纤维滤纸过滤除去茶渣，取茶汤（每份20 mL）加入OTA涡旋混匀以备提取分析使用。

1.3.2 茶汤中赭曲霉毒素A的提取 依据QuEChERS方法原理，并参考Juan等[19]果汁中AFs（黄曲霉毒素）、OTA、AOH（交链孢酚）、AME（交链孢酚单甲醚）等霉菌毒素提取分析方法，设计并对比以下4种茶汤中OTA提取与检测方法。

方法1（M1）：取20 mL茶汤，加入20 mL乙腈和3.0 g柠檬酸钠，涡旋1 min，以5 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复提取2次，合并上清，再加入0.8 g 柠檬酸钠，0.8 g硫酸镁，以5 000 r·min-1离心10 min，取上清10 mL，旋转蒸发浓缩至1.0 mL，用0.22 μm有机系滤膜过滤，然后经HPLC检测。

方法2（M2）：同M1处理，将柠檬酸钠替换为氯化钠。

方法3（M3）：取20 mL茶汤，加入20 mL乙腈和3.0 g氯化钠，涡旋1 min，5 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复提取2次，合并上清，再加入0.8 g 氯化钠，0.8 g硫酸镁，3 g PVPP，1.2 g PSA，5 000 r·min-1离心10 min，取上清10 mL，旋转蒸发浓缩至1.0 mL，用0.22 μm有机系滤膜过滤，然后经HPLC检测。

方法4（M4）：取20 mL茶汤，然后加入20 mL乙腈、20 μL甲酸和3.0 g氯化钠，涡旋1 min后5 000 r·min-1离心10 min，取上清，重复提取2次，合并上清，再加入0.8 g 氯化钠，0.8 g硫酸镁，5 000 r·min-1离心10 min，取上清10 mL，旋转蒸发浓缩至1.0 mL，用0.22 μm有机系滤膜过滤，然后经HPLC检测。

1.3.3 HPLC检测条件 色谱柱型号为ACE C18柱，250 mm × 4.6 mm，5 µm；流动相：乙腈:2%乙酸水（50:50，）；进样量：5 µL；柱温：38 ℃；流速：0.8 mL·min-1；荧光检测器(FLD)：激发波长：333 nm；发射波长：460 nm。

1.3.4 检测标准曲线制作 以HPLC流动相配置1～100 µg·L-1标准品，进行HPLC检测，以OTA检测浓度为x，以色谱峰峰面积为y，进行线性拟合获取OTA检测的标准曲线，以及相关系数的平方（R2），以此标准曲线计算各检测样本OTA检测浓度。

1.4 方法学验证

方法验证所考虑的参数为：方法线性、灵敏度（检测限和定量限）、准确度（回收率）和精密度（重复性和重现性）。

（1）方法线性。取20 mL空白茶汤6份，分别加入OTA，使茶汤中毒素的终浓度为45、20、10、5、1和0 µg·L-1。每个浓度做6个重复，经由4种方法提取检测后，以OTA检测浓度为x，以色谱峰峰面积为y，进行线性拟合获取检测方法的线性方程，以及相关系数（R2），以相关系数来判断检测方法的线性关系，R2的值越接近1则方法的线性越好[18]。

（2）基质效应。取20 mL空白茶汤，分别用4种方法提取后，获得每种方法提取后的茶汤基质，分别用该方法提取的茶汤基质配制OTA基质标准，对照组用乙腈配制相同浓度的OTA溶剂标准。基质标准和溶剂标准配制毒素浓度分别为100、50、20、10、5 和1 µg·L-1。基质标准组和溶剂标准组均做3个重复。经HPLC检测后，以浓度为x，以色谱峰平均面积为y，建立回归方程。基质效应以茶汤基质标准方程的斜率与乙腈配制的溶剂标准方程的斜率比值，即公式（1）。基质效应结果在85%～115%，则可以认为该基质对目标物的检测无显著性影响[19-21]。

基质效应(ME%)=(基质标准方程的斜率/乙腈配制的溶剂标准方程的斜率)×100 （1）

（3）灵敏度。在20 mL空白茶汤中加入OTA至终浓度为5 µg·L-1，分别采用4种方法提取，以流动相梯度稀释，经HPLC检测后，以OTA信号响应值和噪音值的比值来计算定量限（LOQ）和检出限（LOD）。LOQ以OTA响应值∶噪音值=10:1，LOD以OTA响应值∶噪音值=3:1计算，LOQ和LOD越低，则该方法的灵敏度越高[20- 21]。

（4）准确度。取20 mL空白茶汤5份，分别加入OTA，使茶汤中OTA的终浓度为45、20、10、5和1 µg·L-1，每个浓度做6个重复。回收率用公式（2）计算。

=(1×)/2（2）

式（2）中：—回收率；1—经液相检测的浓度（µg·L-1）；2—添加到茶汤中的浓度（µg·L-1）；—稀释倍数。

（5）精密度。精密度验证试验中，设置高浓度（45 µg·L-1）和低浓度（5 µg·L-1）2个组的添加回收实验。每个浓度组每天做6个重复，且不连续重复5 d。根据实验日内回收率和日间回收率以及相对标准偏差（RSD）的比值进行比较分析，以此验证各方法的重复性和再现性。RSD的值越小，方法越可靠性越高（<15%为可接受范围）[20-22]。

（6）方法适用性检测。取不同类型黑茶茶样，包括（六堡茶、安化黑茶、青砖茶、康砖茶和茯砖茶），用方法1.3.1获得茶汤。取制备好的茶汤样品20 mL，添加OTA使其茶汤中毒素浓度分别达到45 µg·L-1（高浓度组）和5 µg·L-1（低浓度组）并分别设置6个重复。以最佳提取检测方法，验证该方法对各类型黑茶茶汤的适用性。

2 结果与分析

2.1 4种方法的线性分析

以普洱（熟茶）为研究材料的添加回收实验，4种不同方法（M1—M4）从普洱茶汤中提取的OTA经HPLC分离，发现茶叶基质中的同步提取物主要在2～6 min洗脱下来，而本研究中的OTA洗脱时间约为13 min。因此，4种方法的茶叶同步提取物与OTA可以较好分开，不对OTA的定性及定量分析产生影响（图1）。

OTA浓度为45 µg·L-1。

Figure 1 OTA chromatograms by four different extraction methods from Pu’er tea infusion

图2 4种提取方法的线性回归方程

Figure 2 The regression equations of four different OTA determination methods

表1 4种方法的线性

注：y：峰面积；x：浓度。

在样本添加浓度为0～45 µg·L-1范围以内，以4种提取检验方法的检测值，计算获得的回归曲线及线性关系，结果如表1和图2所示。方法M1—M4的相关系数的平方值（R2）分别为0.999 7、0.999 6、0.994 1和0.997 1。添加回收实验的分析结果显示，4种不同方法添加回收率的线性关系值均大于0.99，即在0～45 µg·L-1浓度范围内，4种提取分析方法均具有良好的线性相关性，其中以方法M1和M2最佳[18]。

2.2 4种方法的基质效应与灵敏度

基质效应是指基质对目标分析物产生的干扰，从而影响检测结果的准确性。茶叶中含有大量的次级代谢产物如茶多酚、酚酸、色素等，这些物质可以随着OTA同步被提取出来，从而干扰OTA分析的准确性。本试验中，茶汤提取物对4种方法的OTA检测基质效应分别为94.3%、91.1%、95.4%和95.9%（表2），均在标准检测方法可接受范围[20-22]。同时，基质效应测试结果表明，方法M3和M4的茶汤机制效应较小。

表2 4种方法提取基质和乙腈配制的OTA标准曲线方程

注：y：峰面积；x：浓度；STD，表示以乙腈配置的OTA标准品，ME，基质效应。

表3 4种方法添加不同浓度OTA的回收率（n=6）

表4 4种方法的日间精密度（n=30）和日内精密度（n=6）

方法学测试结果显示：方法M1—M4的LOD分别为0.44、0.39、0.38和0.33 µg·L-1；M1—M4的LOQ分别为1.48、1.31、1.27和1.10 µg·L-1。从4种方法检出限来看，方法M4的检出限与定量限最低，具有最高的方法灵敏度。Haas等[13]以HPLC方法检测普洱茶叶中OTA含量，该方法中的LOD为0.5 µg·kg-1，稍高于本研究中的M4；Monbaliu等[23]以UPLC-MS/MS方法检测茶叶中OTA含量，该方法中的LOD为2.6 µg·kg-1。然而，以HPLC方法检测大米及其副产品中OTA含量，LOD仅为0.06 µg·kg-1[8]。以上分析显示，液相色谱法检测茶叶中 OTA的灵敏度高于液质方法，但与大米等食品基质相比，茶叶中OTA检测灵敏度显然偏高，该结果与茶叶或茶汤基质效应关系密切。

2.3 4种方法准确度分析

添加不同浓度的OTA测试4种方法的回收率及标准偏差，结果（表3）显示方法M1在5个不同添加浓度下，回收率在70.5% ～77.9%之间，该结果未达到单个化合物添加回收率在80%～115%之间的基本要求[21-22]。方法M2在添加毒素浓度为45、20和10 µg·L-1条件下，回收率分别为81.5%、85.3%和91.6%，符合回收率基本要求；但是，在添加低浓度为5 和1 µg·L-1时回收率均低于80%，也未达到标准。方法M3在各个浓度下的添加回收率仅在63.1%～76.1%之间，不符合标准化检测方法要求。相比而言，方法M4在5个不同的添加浓度下，回收率在82.5%～99.8%之间，在各浓度条件下均符合标准化检测方法要求，显著优于其他3种方法。同时4种提取检测方法的标准偏差最高值为7.2%（方法M4），最低值为1.4%（方法M1）均在可接受范围内。相比于其他3种方法，方法M4之所以有更高准确度和稳定的回收率，可能与OTA在酸性环境下更易溶于有机提取剂密切相关。本实验结果与Malir 等研究，在酸性条件下（pH < 7）OTA易转移于有机提取相，更少残留于茶汤或果汁水相结果一致[24]。

图3 使用方法4(OTA浓度为45 µg·L-1）提取不同黑茶茶汤的色谱图

Figure 3 OTA Chromatograms from different tea infusions extracted by method M4 (OTA concentration: 45 µg·L-1)

表5 不同黑茶茶汤毒素提取结果（n=6）

2.4 4种方法的精密度分析

检测方法另一个重要的指标即方法的精密度，代表了该方法的重复性和再现性。4种方法的精密度测试结果显示，M4 > M2 > M1 > M3（表4）。方法M4在高浓度毒素组和低浓度毒素组，测试的日内和日间回收率结果分别为90.9%、87.5%，91.9%和92.4%，该结果均优于其他3种方法，且完全符合单个污染化合物分析测试要求。

同时，方法M4在高浓度毒素组和低浓度毒素组分析过程中，日内和日间相对标准偏差结果分别为2.2%、3.2%，5.1%和6.7%，均在正常范围内（<15%）。从以上分析结果来看，方法M4在精密度测试方法中显著优于其他3种方法，尤其是方法M1和M3。因此，根据精密度测试结果，M4最适合于提取茶汤中OTA。

2.5 方法的适用性分析

以普洱（熟茶）茶汤为基质，建立4个提取分析方法，根据以上方法学评估对比分析结果，方法M4是最适宜于普洱茶茶汤中OTA的提取与检测。在此基础上，本研究又同时选取六堡茶、青砖茶、安化黑茶、茯砖茶和康砖茶为测试材料，以普洱茶为对照，评估M4在其他后发酵黑茶中的适用性。结果显示，以M4从6种发酵黑茶茶汤中提取的OTA经HPLC分离，均可以与各自茶汤中同步提取物很好的分离，不会对OTA定性及定量分析产生影响（图3）。HPLC色谱图显示，虽然不同黑茶茶汤基质不影响OTA检测分析，但各茶汤基质有明显差异，茶汤基质出峰时间集中在2 ～6 min；青砖茶杂质峰面积最大，茯砖茶和康砖茶较为相似，六堡茶杂质峰面积较小。根据6种发酵黑茶杂质峰分析，不同黑茶茶汤基质有明显差别。6种不同黑茶茶汤添加回收结果（表5）显示，高浓度组回收率为88.65%～93.26%，低浓度组回收率为89.49%～102.15%；所有添加回收试验标准偏差均小于6.15%。本试验中6种茶汤基质，对以M4为提取方法的OTA检测未产生显著性干扰，添加回收试验表明M4普遍适用于黑茶茶汤中OTA检测。但是，不同类型发酵茶因其茶叶原料、发酵工艺及参与微生物菌群皆有显著的区别，在使用本方法前仍需要做具体的分析和方法学验证。

3 讨论与结论

我国黑茶的消费量仅次于绿茶，且我们周边国家（例如，蒙古国、俄罗斯、印度及东南亚）后发酵黑茶的消费也十分的广泛[16]。近几年，由黑茶渥堆和贮藏过程中是否会发生有害微生物及霉菌毒素污染问题引起了广泛关注。这些问题在引起老百姓饮茶忧虑同时，给发酵茶产业的健康发展也造成了一定影响[7-9]。我国并未发布茶叶、茶汤或茶饮料中OTA检测方法，国标GB 5009.96—2016中关于液体样品检测[25]，只包括植物油脂、酱油、醋、酒类的方法。2017年Pallarés等通过分散液相微萃取方法，以液相色谱串联质谱（LC/MS-MS）检测茶饮料中黄曲霉毒素和OTA等7种霉菌毒素[21]。Monbaliu等采用C18-SPE固相萃取柱净化，建立草药茶茶汤中霉菌毒素 UPLC-MS/MS检测方法[23]。其他研究主要为干茶叶中霉菌毒素的提取分析，关于后发酵黑茶茶汤中OTA的检测还未有所涉及[14-15, 20, 26]。

近年来，关于发酵黑茶中OTA污染研究也陆续开展。陈秋娥等检测分析了44种普洱茶样品，均未检出OTA的污染[11]；王鹭等检测了市售20种各类茶叶样品，也未检出OTA污染[12]。Haas等检测了36种普洱茶样品，发现4份茶叶样品检出OTA，含量分别为0.65、0.65、14.8和94.7 µg·kg-1，参考我国食品中OTA限量范围，其中两份样品含量超过可接受范围[13]；Ye等检测了108个发酵茶样品，发现2份样品检测出OTA，含量分别为5.9和36.4 µg·kg-1，1个样品超出食品中OTA污染可接受水平[14]；Cui等检测了158种后发酵茶样品，两个样品检出黄曲霉毒素B1，浓度为2.07和1.24 µg·kg-1 [15]。Ye[14]和Cui[15]等根据所测定的样品污染水平及膳食摄入数据，分别作了6大类霉菌毒素和4种黄曲霉毒素风险评估，结果显示发酵黑茶的霉菌毒素膳食风险暂不构成可以预见的食品安全风险。

从目前的研究报道来看，茶叶（主要为发酵黑茶）中OTA及其他霉菌毒素检测结果，整体呈检出率低及污染水平低的“双低特点”，但是可靠的检测方法才是检测结果的基本保证。同时关于以上这些研究，一个值得注意的问题是茶叶与其他食品基质不同，茶叶摄入方式为茶汤饮用，茶叶本身直接摄入或与其他食品加工后直接食用比例很小。本实验及相关研究所涉及的赭曲霉毒素和黄曲霉毒素等水溶性较低，在茶叶冲泡过程中有多少毒素可以通过茶水冲泡浸出尚不清楚。因此，进一步研究茶汤中各类霉菌毒素提取方法及在茶水冲泡过程中的浸出率，对充分了解发酵茶叶中霉菌毒素膳食风险有重要意义。

本研究依据QuEChERS基本原理，对普洱茶汤中4种OTA提取检测方法完成对比分析。通过4种方法的线性、灵敏度、准确度和精密度同步比较，确定以含0.1%甲酸酸化乙腈提取、氯化钠和硫酸镁分层的方法M4为最佳提取检测方法。不同茶汤基质测试结果显示，该方法在六堡茶、青砖茶、安化黑茶、茯砖茶和康砖茶等5种后发酵茶汤中也具有适用性。本方法可以对茶汤提取物进行离心浓缩，检测痕量的OTA污染，对后发酵黑茶茶汤OTA检测，霉菌毒素在茶汤中浸出率研究及更准确的膳食风险评估有重要意义。

[1] 陈富桥, 胡林英, 姜爱芹. 我国茶产业发展40年[J]. 中国茶叶, 2019, 41(10): 1-5.

[2] 吕海鹏, 张盛, 林智. 茶的抗菌抗病毒功效[J]. 中国茶叶, 2019, 41(1): 1-6.

[3] 钟玉心, 邓素娥. 浅谈茶叶质量安全现状和监管方向[J]. 农产品加工, 2018(19): 75-77.

[4] 刘新, 张颖彬, 潘蓉, 等. 我国茶叶加工过程的质量安全问题及对策[J]. 食品科学技术学报, 2014, 32(2): 16-19.

[5] 刘新, 陈红平, 王国庆. 中国茶叶质量安全40年[J]. 中国茶叶, 2019, 41(12): 1-9.

[6] 孙威江. 茶叶质量与安全学[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2020.

[7] NGUYEN K T N, RYU D. Concentration of ochratoxin A in breakfast cereals and snacks consumed in the United States[J]. Food Control, 2014, 40: 140-144.

[8] IQBAL S Z, ASI M R, HANIF U, et al. The presence of aflatoxins and ochratoxin A in rice and rice products; and evaluation of dietary intake[J]. Food Chem, 2016, 210: 135-140.

[9] HAJOK I, KOWALSKA A, PIEKUT A, et al. A risk assessment of dietary exposure to ochratoxin A for the Polish population[J]. Food Chem, 2019, 284: 264-269.

[10] World Health Organization, International Agency for Research on Cancer. some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins[M]. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans, 1993, 56: 489.

[11] 陈秋娥. 普洱茶中霉菌毒素之研究论文[D].台北: 台湾大学, 2003．

[12] 王鹭, 杨骅, 谢国祥, 等. 普洱茶、红茶、绿茶中真菌毒素的检测[J]. 中国中药杂志, 2017, 42(24): 4801-4806.

[13] HAAS D, PFEIFER B, REITERICH C, et al. Identification and quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea[J]. Int J Food Microbiol, 2013, 166(2): 316-322.

[14] YE Z, WANG X, FU R, et al. Determination of six groups of mycotoxins in Chinese dark tea and the associated risk assessment[J]. Environ Pollut, 2020, 261: 114180.

[15] CUI P, YAN H B, GRANATO D, et al. Quantitative analysis and dietary risk assessment of aflatoxins in Chinese post-fermented dark tea[J]. Food Chem Toxicol, 2020, 146: 111830.

[16] ANASTASSIADES M, LEHOTAY S J, STAJNBAHER D, et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. J AOAC Int, 2003, 86(2): 412-431.

[17] SCHENCK F J, CALLERY P, GANNETT P M, et al. Comparison of magnesium sulfate and sodium sulfate for removal of water from pesticide extracts of foods[J]. J AOAC Int, 2002, 85(5): 1177-1180.

[18] KWON H, LEHOTAY S J, GEIS-ASTEGGIANTE L. Variability of matrix effects in liquid and gas chromatography-mass spectrometry analysis of pesticide residues after QuEChERS sample preparation of different food crops[J]. J Chromatogr A, 2012, 1270: 235-245.

[19] JUAN C, MAÑES J, FONT G, et al. Determination of mycotoxins in fruit berry by-products using QuEChERS extraction method[J]. LWT, 2017, 86: 344-351.

[20] YE Z, CUI P, WANG Y, et al. Simultaneous determination of four aflatoxins in dark tea by multifunctional purification column and immunoaffinity column coupled to liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. J Agric Food Chem, 2019, 67(41): 11481-11488.

[21] PALLARÉS N, FONT G, MAÑES J, et al. Multimycotoxin LC-MS/MS analysis in tea beverages after dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME)[J]. J Agric Food Chem, 2017, 65(47): 10282-10289.

[22] European Commission. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed[R]. European Commission Document No. SANTE/11945/2015, 2015.

[23] MONBALIU S, WU A B, ZHANG D B, et al. Multimycotoxin UPLC−MS/MS for tea, herbal infusions and the derived drinkable products[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(24): 12664-12671.

[24] MALIR F, OSTRY V, PFOHL-LESZKOWICZ A, et al. Transfer of ochratoxin A into tea and coffee beverages[J]. Toxins (Basel), 2014, 6(12): 3438-3453.

[25] 国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定: GB 5009.96—2016[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017.

[26] XU P, YING L, WU J, et al. Safety evaluation and antihyperlipidemia effect of aqueous extracts from fermented puerh tea[J]. Food Funct, 2016, 7(6): 2667-2674.

Extraction and detection of ochratoxin A in dark tea infusions

YAN Hangbin, ZHAO Weifan, TANG Mengting, ZHOU Yu

(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

In daily tea drinking, the tea leaves may be contaminated with a certain amount of mycotoxins due to improper processing or storage, meanwhile, we still lack of understanding of the mycotoxin migration rate and actual intake during the tea brewing process. Therefore, we aim to establish a method for the extraction and detection of ochratoxin A (OTA) in tea infusions, so as to make an appropriate safety assessment of biotoxins ingested through tea infusion. In this study, acetonitrile was used as major solvent to extract OTA in tea infusions, and different salt ions were added to separate acetonitrile and aqueous phase. The supernatant was cleaned and analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography), four extraction methods were established and compared, and the most appropriate method was selected by evaluation of the accuracy, linearity, precision, sensitivity and other indicators. As results, method 4, which was extracted with acetonitrile containing 0.1% formic acid and separated the acetonitrile and aqueous phase with sodium chloride and magnesium sulfate, obtained the best results. Method validation of method 4 showed that recovery was between 82.5% and 99.8%, the standard deviation was 1.4% - 7.3%, and the correlation coefficient of the determination method was 0.997 1. In high-concentration fortified group, the intra-day recovery was 90.9%, and the relative standard deviation (RSD) was 2.2%; the inter-day recovery was 87.5% and the RSD was 3.2%. In low-concentration fortified group, the intra-day recovery was 91.9% and the RSD was 5.2%; the inter-day recovery was 92.4% and the RSD was 6.7%. The limit of quantification of the method was 1.1 µg·L-1, and the detection limit was 0.33 µg·L-1. Evaluation results of different types of dark tea infusions showed that the recovery rates of the method were all higher than 88.65%. In conclusions, by comparison of the four developed methods, method 4 is better than the other three methods, and it is suitable for the detection of OTA in tea infusions. The method developed in this study is of great significance for OTA migration rate evaluation from dry tea to tea infusions and appropriate risk assessment.

tea infusion; ochratoxin A; method establishment; HPLC; method validation

TS272

A

1672-352X (2021)06-0997-08

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.010

2022-1-6 18:03:02

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1253.020.html

2021-03-16

安徽省重点研发计划项目（202004h07020007）资助。

闫航滨，硕士研究生。E-mail：1072735383@qq.com

通信作者:周 育，教授，博士生导师。E-mail：microbes@ahau.edu.cn