重组人粒细胞刺激因子生物学活性国家标准品的制备及协作标定

刘兰，于雷，丁有学，郭莹，史新昌，饶春明

中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050

重组人粒细胞刺激因子（recombinant humna gra- nulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）是我国治疗性重组生物制品的重要产品，该产品为小容量注射剂，主要用于治疗放疗、化疗及骨髓移植后中性粒细胞减少症［1］。

截至2019 年6 月，国家食品药品监督管理局网站（http: ／ ／ www.sda.gov.cn ／ WS01 ／ CL0001 ／）数据显示，我国现有15 家相关制药企业，10 个规格，69 个批准文号。国内rhG-CSF 制品生物学活性国家标准品（批号：98 ／ 01；文号：2001 国生标字0005，以下简称第1 批国家标准品）量值可溯源至WHO 的第1 批rhG-CSF 生物学活性标准品（88 ／ 502），以下简称第1 批国际标准品［2］。目前，第1 批国际标准品已更替为第2 批国际标准品，因此，本研究以第2 批国际标准品量值为溯源，制备第2 批国家标准品（以下简称待标品），以期为rhG-CSF 制品的质量控制提供保障。

1 材料与方法

1.1 标准品及原液 第2 批国际标准品购自NIBSC；rhG-CSF 原液（批号：CS2015B07）购自厦门特宝生物工程股份有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 人血白蛋白（A502F6661）购自奥克特珐玛药剂生产有限公司；海藻糖（O0802A）购自上海西宝生物科技有限公司；甘露醇（1508059）购自河北华旭药业有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯；水分测定仪851 Titrando 购自瑞士Metrohm公司。

1.3 待标品的制备 100 μg ／ mL rhG-CSF 原液加入冻干保护剂（人血白蛋白1.0 mg ／ mL、海藻糖1.0 mg ／ mL、氯化钠溶液9.0 mg ／ mL、甘露醇7.0 mg ／ mL），按0.5 mL ／ 瓶分装，冻干后充氮封口，置-20 ℃保存。于分装过程中，约每500 支取1 次样（共5 次），称重，计算灌装变异度。

1.4 待标品关键质量属性的检测 按《中国药典》三部（2015 版）［3］规定的方法对待标品进行外观、无菌、水分和生物学活性检测。

1.5 待标品热加速稳定性的检测 将待标品置-20、4、25、37 ℃分别放置1、2 和3 个月，各时间点取3 支样品，以-20 ℃保存的待标品为参照，计算其他温度保存待标品的相对生物学活性。同时采用热动力温度衰减软件建立拟合Eyring equation 方程：ln{k（t）} =A - B ／ T + ln（T），估算所制待标品的衰减时间。

1.6 待标品的协作标定 组织国内5 家实验室参加协作标定。采用《中国药典》三部（2015 版）［3］通则3525 中阐述的方法，即NFS-60 细胞／ 溴化四唑蓝（MTT）显色法／酸性裂解液／四参数方程分析法进行标定。将待标品分成A 和B 两组，以第2 批国际标准品进行平行检测，同次试验在3 块96 孔板上进行，于不同时间进行3 次试验。

2 结 果

2.1 待标品的分装精度 5 个阶段样品检测结果均值分别为0.501 2、0.500 0、0.500 5、0.500 1 及0.501 9 g，变异度分别为0.32%、0.31%、0.34%、0.36%、0.27%，总变异度＜1%，表明分装精度较高。

2.2 待标品的关键质量检测 待标品外观为白色疏松体，加入1 mL 注射用水后复溶为无色澄明液体；无菌生长；水分含量为0.4%；生物学活性为具有与rhG-CSF 一致的使NFS-60 细胞增殖效应。

2.3 待标品的热加速稳定性 热加速稳定性数据见表1，获得热动力温度衰减软件拟合Eyring equation方程为：ln{k（t）} = 18.49 - 7 853 ／ T + ln（T），R2=0.880。预测待标品于-20 ℃贮存时，生物学活性衰减10%约需111 个月；于-30 ℃贮存时，生物学活性衰减10%约需417 个月。

2.4 待标品的协作标定 待标品A 和B 的算术平均值分别为4.29 × 106和4.26 × 106IU ／ 支，标准差分别为为0.48 × 106和0.64 × 106IU ／ 支；待标品A 和B 合并后算术平均值为4.27×106IU／支，标准差为0.56 × 106IU ／ 支。均值95%的置信区间为4.15×106～4.39×106IU／支，约为97%～103%。待标品A 和B 对数值转换后的几何平均值分别为4.26×106和4.21×106IU／支，几何变异度-1（geometric variability-1，GCV-1）分别为为0.12 和0.16；待标品A 和B 合并后几何平均值为4.23 × 106IU ／ 支，GCV-1为0.14。均值95%的置信区间为4.12×106～4.35×106IU／支，约为97% ～103%。见表2。本次协作标定制备的待标品赋值为4.2 × 106IU ／ 支。

表1 热稳定性试验结果（相对生物学活性）Tab.1 Test result for thermal stability（relative biological activity）

表2 协作标定结果Tab.2 Result of collaborative calibration

3 讨 论

rhG-CSF 生物学活性标准品在rhG-CSF 生物学活性测定过程中起到重要作用，可用于定量批生产的rhG-CSF 生物学活性量值［4］。rhG-CSF 生物学活性国家标准品对应用区域内rhG-CSF 生物学活性量值的标准化和统一化具有重要意义，是rhG-CSF 生物学活性溯源的源头。rhG-CSF 生物学活性标准品稳定性对应用区域内rhG-CSF 制品的定量有重要影响，稳定性不佳将使rhG-CSF 生物学活性量值误差较大，标准品随着保存时间的延长，若其生物学活性持续降低将使被定量制品的生物学活性发生上升趋势的飘移。另外，标准品的均匀性也会对检测的不确定度产生附加影响。

Eyring 方程是关于化学反应速率常数与温度之间的关系式。该公式的首要前提是不同温度下发生的反应一致（仅速率不同），进而在贮存寿命定量评估中应用较广泛［5-9］。该公式描述温度对某种过程反应速率的影响，若几个反应共同决定试验样品的反应速率，如标准品的贮存过程中发生氧化和聚集等［10-11］，则公式预测会产生偏移。通常将热加速试验结果作为标准品存放的温度和期间核查间隔的参考。

协作标定方案中的待标品A 和B 为同一待标品的不同抽样组，即在同一块96 孔板上做了两支供试品，目的是评估参与协作标定的实验室的检测能力［4］，结果表明，参与实验室间检测结果的变异度均在可接受范围内。

本研究制备了第2 批rhG-CSF 生物学活性国家标准品，并联合5 家实验室进行了协作标定。制备的标准品各项关键指标符合《中国药典》三部（2015 版）［3］的要求，且热加速稳定性良好，置-30 ℃可保存30 年以上；协作标定制备的标准品赋值为420 万IU ／ 支。