过表达脑红蛋白对大鼠脊髓损伤的神经保护作用及其机制

王浩，张雄，唐宁曼，王晓林

1.四川省达州市中心医院，四川 达州635000；2.重庆医科大学基础医学院，重庆400016

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种具有很强破坏性的损伤方式，可导致伤者损伤下方的感觉和运动功能完全丧失。SCI 后，机体存在原发性和继发性的损伤机制。原发性损伤是由于损伤直接导致脊髓水肿、白质内轴突纤维连续性中断和神经元立即死亡，从而导致难以逆转和恢复的神经系统功能障碍。而继发性损伤则是在原发性损伤后，脊髓经历了一系列的病理变化，如缺氧、活性氧生成、缺血、凋亡、自噬和炎症等［1-2］，而这些病理改变是临床治疗干预脊髓损伤的潜在目标［3-4］。

脑红蛋白（neuroglobin，NGB）是一类广泛分布于脊椎动物中枢和周围神经系统的新型携氧球蛋白，其过表达可通过增强低氧感知或低氧反应来保护神经元免受缺血缺氧的影响，还可通过清除NO 或调节活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的生成，在包括SCI 在内的多种神经系统疾病中发挥很好的神经保护作用［5-7］，但其机制尚不明确［8-9］。本实验在SCI模型大鼠的脊髓损伤部位注射腺相关病毒携带的Ngb基因，观察过表达Ngb 对SCI 大鼠神经功能的影响，并探讨其机制，为临床治疗SCI 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 质粒 AAV-Ngb和对照AAV-Con 均由山东维真生物科技有限公司设计并构建（将大鼠Ngb基因序列克隆入病毒载体，将携带Ngb的重组质粒、辅助质粒等共转染入HEK293 细胞，72 h 后收获病毒颗粒）。

1.2 实验动物 清洁级雄性成年（5 ～6 周龄）SD 大鼠90 只，体重150 ～200 g，购自重庆医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（渝）2016-0001。所有大鼠均置于重庆医科大学动物中心SPF 级代养室饲养，每笼4 只，温度保持（24 ± 1）℃，12 h 光照昼夜循环，给予专用鼠粮和水，术前12 h 禁食，可饮水。

1.3 主要试剂及仪器 PI3K 抑制剂LY294002 购自美国Sigma 公司；凋亡原位检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；caspase-3 和caspase-9 酶活性检测试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒及SDS-Page胶配置试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；兔抗鼠caspase-3、caspase-9、Akt 和p-Akt 抗体购自Santa Cruz 生物科技公司（上海浦东新区）；内参抗体β-actin和HRP 标记的山羊抗兔IgG 购自北京博鳌森生物技术有限公司；PVDF 膜和ECL 发光试剂盒购自美国Bio-rad 公司。

1.4 SC I大鼠模型的建立及分组处理 将90 只SD大鼠随机分为5 组：假手术组、SCI 模型组（SCI）、阴性对照组（NC）、AAV-Ngb组（Ngb）和AAV-Ngb+LY249002 组（Ngb+LY），每组18 只。采用改良Allen′s法［10］制备SCI 大鼠模型：将大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，取仰卧位固定于操作台上，剃除毛发消毒后，于T10 棘突为中心作一长为3 cm 的切口，逐层暴露T10 背侧面，并除去棘突和椎板。用改良Allen′s重物坠落装置打击大鼠T10 脊髓背侧面，打击成功后止血缝合伤口。术后3 d 内行肌肉注射青霉素以防治感染，SCI 模型建立成功的标志为大鼠躯体颤动，双下肢抽搐，出现迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动，脊髓撞击处有出血水肿。假手术组大鼠仅暴露T10脊髓背侧面，其余各组依次用微量注射器将生理盐水、AAV-Con（1 滋g ／ 滋L）、AAV-Ngb（1 滋g ／ 滋L）溶液和AAV-Ngb（1 滋g ／ 滋L）+ LY294002 液（5 滋mol ／ L）注入损伤脊髓T10 所在节段的中点以及头尾两侧，共18 滋L。

1.5 神经功能评估 采用BBB（Basso Beattie Bresnahan）评分法［11］。术前2 d，将所有大鼠依次放入自制的泡沫盒中熟悉环境。每天3 次，注意观察大鼠臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。建模成功后，于损伤后1、3、7、14、21、28 d，将各组所有大鼠放入泡沫盒中，记录其后肢运动功能。无后肢运动为0 分，后肢运动正常为21 分，该过程由两名不熟悉实验方案的观察者在每个时间点独立观察5 min，并记录其分值。

1.6 细胞凋亡检测 处死各组大鼠后，制备脊髓切片，按照凋亡原位检测试剂盒说明书进行Tunel 染色：切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，用H2O2封闭30 min；0.15 mol ／ L PBS 振洗3 次，每次5 min，再用Proteinase K 进行细胞通透30 min；PBS 洗涤2次，用3%双氧水封闭液，将切片置入封闭液中，室温下放置10 min；PBS 冲洗后，用平衡液平衡10 min；加入Tunel 反应混合液于标本上，加盖玻片，37 ℃反应1 h；加入2 × SSC 液终止反应后，PBS 洗涤3 次，行DAB 染色，苏木素复染，中性树胶封片观察。细胞核染成棕褐色判为阳性细胞。

1.7 caspase-3、caspase-9 酶活性检测 处死各组大鼠，迅速取出脊髓组织，加入蛋白裂解液，研磨后离心获得上清液，移入已预冷的EP 管中，按试剂盒说明操作，立即测定caspase-3、caspase-9 酶活性。根据caspase-3 酶活性变化释放的pNA 与caspase-3 的活性呈正比，将pNA 释放的A405值作为caspase-3、caspase-9 酶活性值。

1.8 A kt、caspase-3 和caspase-9 蛋白表达检测 采用Western blot 法。称取10 mg 脊髓组织，加入1 mL RIPA 裂解液（含0.01 mL PMSF），研磨后，4 830 ×g离心15 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度，变性后于-80 ℃冰箱保存。经8% SDS-PAGE 分离后，转至PVDF 膜上，以5%脱脂奶粉室温下封闭1 h；加入兔抗鼠caspase-3、caspase-9、p-Akt、T-Akt 和β-actin 抗体（均用TBST 1∶200 稀释），4 ℃冰箱中孵育过夜；TBST 冲洗后，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000 稀释），室温下孵育2 h；ECLipse 发光，运用凝胶成像系统采集图片并分析各目的蛋白与内参βactin 光密度值的比值。试验重复3 次，取平均值。

1.9 统计学分析 应用SPSS 22.0 软件进行统计分析，数据以均数± 标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α = 0.05，以P＜为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的BBB 评分 假手术组所有大鼠后肢的BBB 评分均为21 分，即满分，提示其运动能力完全正常。而在SCI 术后1 d，其余4 组大鼠的BBB评分均处于极低水平，组间比较差异无统计学意义（F=1.214，P=0.172）；术后3 d，这4 组大鼠的BBB评分均有所提高，差异无统计学意义（F=1.723，P=0.094）；术后7 d，Ngb 组大鼠的BBB 评分明显高于SCI 和NC 组，且差异有统计学意义（F =3.175，P =0.035），随着时间的推移，术后14、21 和28 d，BBB评分进一步升高（F =4.892 ～6.726，P =0.000 ～0.008）；Ngb + LY 组大鼠术后14、21、28 d 的BBB评分较Ngb 组显著降低（F=3.210 ～4.196，P=0.017 ～0.037）。见图1。

图1 各组大鼠术后不同时间的BBB 评分Fig.1 BBB scores of rats at various time points after SCI in various groups

2.2 各组大鼠脊髓组织中细胞的凋亡情况 假手术组大鼠脊髓组织中几乎见不到凋亡细胞。SCI 和NC组凋亡细胞数量明显多于假手术组，且随着时间的推移，两组凋亡细胞数量有所降低，但差异无统计学意义（F =2.238，P =0.075）；SCI 术后7 d，Ngb 组凋亡细胞数量较SCI 组明显降低（F =3.251，P =0.041），术后28 d，达最低值（F=6.027，P=0.002）；Ngb + LY 组凋亡细胞数量较Ngb 组显著增加（F =4.126，P =0.018）。见表1 和图2。

表1 各组大鼠SCI 术后不同时间脊髓组织中的细胞凋亡数（±s，n = 3）Tab.1 Number of apoptotic cells in spinal cord tissue of rats in various groups at various time points after SCI（±s，n = 3）

表1 各组大鼠SCI 术后不同时间脊髓组织中的细胞凋亡数（±s，n = 3）Tab.1 Number of apoptotic cells in spinal cord tissue of rats in various groups at various time points after SCI（±s，n = 3）

注：a 表示与SCI 组比较，P ＜0.05；b 表示与Ngb + LY 组比较，P ＜0.05。

组别 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 28 d假手术 2.37 ± 0.57 2.47 ± 0.31 2.18 ± 0.42 3.27 ± 0.49 2.98 ± 0.52 3.47 ± 0.29 SCI 48.34 ± 7.89 48.65 ± 4.57 46.39 ± 2.98 45.89 ± 8.71 45.34 ± 6.31 44.38 ± 5.23 NC 47.63 ± 6.52 47.25 ± 5.48 46.15 ± 8.45 45.78 ± 4.35 44.59 ± 6.14 44.23 ± 7.51 Ngb 46.19 ± 6.48 44.39 ± 6.19 36.78 ± 4.28a 30.63 ± 3.78a，b 25.65 ± 3.29a，b 18.72 ± 6.31a，b Ngb + LY 46.39 ± 2.69 45.87 ± 5.42 37.64 ± 4.23 34.91 ± 5.46 39.75 ± 3.64 40.15 ± 7.21

图2 Tunel 染色观察SCI 术后7 d 各组大鼠脊髓组织中细胞凋亡情况（× 100）Fig.2 Tunel staining of apoptotic cells in spinal cord of rats in various groups 7 d after SCI（× 100）

2.3 各组大鼠脊髓组织中caspase-3 和caspase-9 酶活性 假手术组大鼠脊髓组织中caspase-3 和caspase-9酶活性均很低；与假手术组比较，SCI 术后1 d，其余4 组caspase-3 和caspase-9 酶活性均显著升高（F =22.831 ～35.674，P =0.000 ～0.004），但组内比较差异无统计学意义（F =2.158 ～2.764，P =0.069 ～0.095）；术后3 d，各组caspase-3 和caspase-9 酶活性略降低，但差异无统计学意义（F=2.328 ～2.821，P =0.054 ～0.067）；术后7 d 开始，Ngb 组caspase-3和caspase-9 酶活性均显著降低（F =3.514 ～4.386，P =0.012 ～0.038），至术后28 d，达最低值（F =6.538 ～8.751，P =0.000 ～0.002）；Ngb + LY 组caspase-3 和caspase-9 酶活性较Ngb 组显著升高（F=3.452 ～4.389，P =0.011 ～0.024）。见图3。

2.4 各组大鼠脊髓组织中A kt、caspase-3 和caspase-9蛋白的表达 与假手术组比较，SCI 和NC 组大鼠脊髓组织中p-Akt 蛋白的表达水平显著下降（F =16.231 ～25.764，P =0.000 ～0.003），而与凋亡密切相关的caspase-3 和caspase-9 蛋白表达水平则明显升高（F =19.472 ～29.324，P =0.000 ～0.002）；Ngb 组p-Akt 蛋白的表达显著升高，而caspase-3 和caspase-9 蛋白的表达显著下降（F =5.784 ～8.951，P =0.002 ～0.008）；Ngb + LY 与Ngb 组比较，p-Akt蛋白的表达显著下降（F=6.238 ～8.954，P=0.002 ～0.007），而caspase-3 和caspase-9 蛋白的表达显著升高（F =5.136 ～7.358，P =0.004 ～0.009）。见图4 和图5。

图3 各组大鼠术后不同时间的caspase-3（A）和caspase-9（B）酶活性Fig.3 Activity of caspase-3（A）and caspase-9（B）of rats in various groups at various time points after SCI

图4 Western blot 分析各组大鼠脊髓组织中T-Akt、p-Akt、caspase-3 和caspase-9 蛋白的表达Fig.4 Western blotting of expressions of T-Akt，p-Akt，caspase-3 and caspase-9 in spinal cord tissues of rats in various groups

图5 各 组大鼠脊 髓 组 织 中T-Akt、p-Akt、caspase-3 和caspase-9 蛋白的表达Fig.5 Expressions of Akt，p-Akt，caspase-3 and caspase-9 in spinal cord tissue of rats in various groups

3 讨 论

通常来说，脊髓受到原发性的机械损伤后，大量的神经元变性、坏死，继而导致神经传导中断，使受损部位以下的运动、感觉功能部分或完全丧失。随着时间的推移，继发性损伤过程被激活，出现一系列的病理变化，进一步加重损伤。因此，继发性损伤往往比原发性损伤更为严重。由于继发性损伤是一个在细胞和分子水平上主动调节的过程，该过程可逆和可控［12］，为治疗干预SCI 带来了希望。

Ngb 是由德国生物学家BURMESTER 等［13］于2000 年发现的一种新型携氧球蛋白，在神经元内表达丰富。在人体内，Ngb 在脑内的表达存在一个动态的变化过程，即随着年龄的增加而呈递减趋势［14］。研究表明，Ngb 与氧有高度的亲和力，能促进氧向线粒体扩散或直接介导氧在线粒体内的传递，促进三磷酸腺苷的生成，继而促进神经元的物质代谢［15］。以往更多的研究均集中于Ngb 在保护神经元免受缺血缺氧造成的损伤中所起的重要作用，其机制也较明确［5-6］。新的研究也证实，过表达Ngb 对SCI 也有保护作用，其机制与抑制细胞凋亡、ROS 的产生、抗氧化等有关［8-9］，但深入的机制尚不明确。

本研究选取雄性SD 大鼠建模，是为了避免内源性雌激素对实验所造成的影响［16］；采用Allen′s 改良法建模，是由于该方法是一种经典的SCI 建模方式，具有操作简便、成功率高、成本低等特点。模型构建成功后，采用常用于动物SCI 后运动功能状态的BBB 系统进行评分，结果显示，SCI 后1、3 d，与假手术组比较，其余4 组的评分均明显处于很低水平；随着时间的推移，BBB 评分均有所升高，SCI 和NC组轻微升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；而Ngb组明显升高，且随着时间的推移，升高趋势更明显，提示Ngb 促进了SCI 后神经功能的恢复。

众所周知，凋亡是一种自然的生理过程，在维持细胞生长、促进脊髓发育过程中起关键作用。而细胞凋亡是继发性SCI 的重要环节。因此，本实验采用Tunel 染色法观察了细胞的凋亡情况，结果显示，与假手术组比较，SCI 和NC 组凋亡细胞数明显增多，而Ngb 组凋亡细胞数又显著降低。细胞的凋亡经历了诱导、调控和效应3 个阶段，而caspase 蛋白酶家族在该过程中起重要作用。caspase-9 是凋亡的启动子，细胞受刺激后，凋亡的线粒体途径被激活，线粒体释放CytoC，在ATP／dATP 的参与下与Apaf-1结合，使其发生构象进而寡聚化，与pro-caspase-9 之间相互作用，形成凋亡caspase-3，通过特异性裂解一套底物蛋白而使细胞发生凋亡。因此，caspase-3 和caspase-9 的活性及蛋白表达水平可直接反应SCI 部位细胞的凋亡情况。本研究发现，在SCI 和NC 组中，与凋亡关系最为密切的caspase-3 和caspase-9的酶活性很高，蛋白表达水平也很高，均明显高于假手术组；而过表达Ngb 后，caspase-3 和caspase-9 的酶活性及蛋白水平明显降低。上述结果提示，过表达Ngb 能显著抑制SCI 诱导的细胞的凋亡水平。

SCI 后，神经元中许多信号通路可被迅速激活，如PI3K ／ Akt、ERK1 ／ 2、Nf-kappaB 等通路，它们在促凋亡和抗凋亡基因的表达中起重要作用。PI3K ／AkT 信号转导通路是体内重要的调控细胞存活的信号通路，其在细胞生长、发育、分化、存活和凋亡方面发挥重要作用［17］。研究发现，应用Akt-siRNA 可阻断Akt 的磷酸化，从而增强capase-9 的活性，进而促进肝癌细胞凋亡的发生［18］。LI 等［19］在对阿尔茨海默病的研究中发现，过表达Ngb 可通过激活PI3K ／Akt 信号通路，进而抑制下游靶基因caspase-3 和caspase-9 活性而抑制神经元的凋亡，从而保护神经元。本实验发现，应用PI3K ／ Akt 抑制剂LY249002与Ngb 联合作用后，与Ngb 组比较，BBB 评分又显著降低，细胞的凋亡数也明显升高，而caspase-3 和caspase-9 酶活性及蛋白表达水平也明显升高，即LY249002 拮抗了Ngb 的保护作用。

综上所述，过表达Ngb 对SCI 后有保护作用，能够促进其运动功能的恢复，其机制与激活PI3K ／ Akt通路，进而抑制下游靶基因caspase 家族（caspase-3和caspase-9）的活性及蛋白表达水平，进一步抑制细胞的凋亡密切相关，丰富了Ngb 治疗SCI 的抗凋亡作用及机制的理论基础。