不同佐剂联合抗原表位融合蛋白对流感疫苗免疫原性的影响

周云，方超，王丽，祁碧玉，金香玉，杨世龙，谭小东

安徽智飞龙科马生物制药有限公司，安徽合肥230088

流感病毒引起的流行性感冒是人类每年面临的全球性危害之一，控制流感暴发和传播主要依靠接种疫苗。已上市的流感疫苗无法产生广谱抗体，病毒血凝素（hemagglutinin，HA）会快速漂变。WHO PPC（WHO Preferred Product Characteristics）于2017 年对下一代流感疫苗开发提出了新的目标：2027 年的流感疫苗针对甲型流感的持续保护至少达5 年［1］。因此，新型流感疫苗的开发和研制迫在眉睫。

目前，新型流感疫苗的抗原设计主要考虑蛋白保守序列，常用的靶点包括：HA 头部和茎部结构域、M2 蛋白胞外离子通道（extracellular ion channel of M2 protein，M2e）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和基质蛋白M1［2］。流感融合蛋白候选疫苗M-001 由HA、M1、NP的9 个抗原表位组成，一项Ⅰ期临床研究的结果显示，其可激发CD4+和CD8+淋巴细胞活性，促进IL-2和干扰素γ 的分泌［3］；使用初免-加强策略的Ⅱ期临床研究中，用M-001 初免可显著增强季节性流感疫苗（TIV）和H5N1 型流感疫苗的血凝抑制反应［4-5］。类似的候选疫苗Flu-V 由M1、M2、NP 和PB1 相关的6 个保守抗原表位融合而成，含佐剂Montanide ISA-51，能够诱导产生HLA-A*0201 介导的CD8+T 细胞免疫反应，保护小鼠免于致死剂量A／Puerto Rico／8 ／34 毒株攻毒而死亡［6］。

本研究采用人流感病毒HA、NP、基质蛋白M1抗原表位融合蛋白（FP），分别辅以氢氧化铝、聚肌胞（PolyIC）+ 氢氧化铝和阳离子佐剂免疫小鼠，通过检测甲、乙型流感病毒血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）抗体和HA IgG 抗体水平，比较其在小鼠体内对季节性流感疫苗毒株免疫原性的影响。

1 材料与方法

1.1 抗原及佐剂 抗原FP 为9 个抗原表位连接后重复5 次融合而成，参照文献［3］设计并优化后用于CHO 细胞表达，基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，交付产品为重组pUC57 质粒；氢氧化铝佐剂购自德国Brenntag 公司；生理盐水购自四川科伦药业股份有限公司；阳离子佐剂和PolyIC 佐剂由本公司自制。

1.2 疫苗及标准品 四价流感病毒裂解疫苗（QIV）为本公司试制，采用2019 ／ 2020 流感季北半球推荐毒株（H1N1 型毒株：IVR-190，H3N2 型毒株：NYMC X-327，B ／ Y 型毒株：B ／ phuket ／ 3073 ／ 2013，B ／ V型毒株：NYMC BX-69A，均购自NIBSC）；检测用2019 ／2020 流感季H1N1 型IVR-190、H3N2 型NYMC X-327、B ／ Y 型B ／ phuket ／ 3073 ／ 2013、B ／ V 型NYMC BX-69A 和2018 ／ 2019 流感季H3N2 型IVR-186 抗原标准品均购自NIBSC。

1.3 实验动物 SPF 级BALB／c 小鼠50 只，雌性，6 ～8 周龄，体重18 ～ 22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。动物合格证号：1107262011001571。

1.4 细胞、载体及菌株 CHO-S 细胞和pCEP4 载体购自美国Invitrogen 公司；感受态大肠埃希菌DH5α购自美国Thermo 公司。

1.5 主要试剂 无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Plasmid Midi Kit 购自美国OMEGA 公司；限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ购自日本TaKaRa 公司；T4 DNA 连接酶购自宝日医生物科技有限公司；酶切产物纯化回收试剂盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit 购自全式金生物技术有限公司；OPTI-MEM 培养基购自美国Gibco 公司；鼠源HA Tag（YPYDVPDYA）单克隆抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司；脱脂乳粉购自美国BBI Life Sciences 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自美国Thermo 公司；显色液、终止液和Tween-20 购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.6 重组表达质粒的构建 将合成的重组质粒pUC57-FP 用Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，目的基因胶回收后连接至pCEP4 表达载体，构建重组表达质粒pCEP4-FP。参照质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 细胞转染及FP 蛋白表达的鉴定 采用Western blot 法［7］。将序列验证无误的pCEP4-FP 质粒线性化后转染至CHO-S 细胞，48 h 后收集上清和细胞，制备样品，Western blot 检测目的蛋白的表达：FP 蛋白样品经10% SDS-PAGE 分离后，电转移至PVDF膜上，以含5%脱脂奶粉的PBST 37 ℃封闭1 h；加入鼠源HA Tag 单克隆抗体（1∶1 000 稀释），37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤3 次，每次10 min，加入羊抗鼠IgGHRP（1∶5 000 稀释），37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤5次，每次10 min，加入HRP 显色液，暗处显色5 min，凝胶成像系统拍照。

1.8 动物免疫 将小鼠按体重随机分为5 组：阴性对照组、抗原组和配伍1、2、3 组，每组10 只，分别于第0、14 天经颈部皮下依次注射0.2 mL 生理盐水、FP 蛋白、FP 蛋白+ 铝佐剂、FP 蛋白+ 阳离子佐剂和FP 蛋白+ PolyIC + 铝佐剂，每只小鼠FP 蛋白抗原使用剂量为5 μg，佐剂使用剂量为铝佐剂20 μg、PolyIC 100 μg、阳离子佐剂0.1 mL；第28 天使用0.5 mL QIV 经腹腔加强免疫1 针。第28 天免疫前及第42 天每组各取5 只小鼠，眼球摘除采血，分离血清，检测HI 抗体效价或HA IgG 抗体。

1.9 H I抗体检测 参照文献［3］，采用血凝抑制法检测QIV 对应4 种型别毒株（2019 ／ 2020 流感季，同源株）或IVR-186（2018 ／ 2019 流感季，非同源株）的HI 抗体效价，其中HI 抗体效价小于1∶10 的按照1∶5 计，并计算HI 抗体效价几何平均数（GMT）、GMT 增长倍数及阳转率。

1.10 H A IgG 检测 采用ELISA 法。每组小鼠血清混合后检测，重复3 次。分别采用H3N2 型病毒NYMC X-327（2019 ／ 2020 流感季，同源株）或IVR-186（2018 ／ 2019 流感季，非同源株）HA 蛋白包被酶标板过夜，加入小鼠血清（1 ∶1 000 稀释），37 ℃作用1 h；洗板后，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1 ∶5 000 稀释），37 ℃作用1 h；PBST 洗板后，37 ℃作用10 min 显色，加入终止液，在酶标仪450 nm 波长处测定吸光度值。QIV 免疫后与免疫前A450的比值记为HA IgG 抗体滴度增长倍数。

1.11 统计学分析 应用Graphpadprism 5 软件进行统计分析，组间差异的比较采用One way ANOVA检验，阳转率比较采用卡方检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组表达质粒的鉴定 重组表达质粒pCEP4-FP 经HindⅢ和XhoⅠ双酶切，可见3 130 bp 的目的基因条带和10 180 bp 的载体条带，大小与预期一致，见图1。测序后得到3 130 bp 大小的核苷酸序列，与设计的理论基因序列完全一致，表明重组真核表达质粒构建正确。

图1 重组表达质粒pCEP4-FP 的双酶切（HindⅢ／ XhoⅠ）鉴定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pCEP4-FP（HindⅢ／ XhoⅠ）

2.2 FP 蛋白的W estern blot鉴定 结果显示，融合蛋白FP 相对分子质量约为110 000，大小与预期一致，对照CHO-S 细胞未见特异性条带，见图2。

2.3 H 1N 1 型H I抗体效价 QIV 免疫前，所有小鼠均未检出HI 抗体。QIV 免疫后，各组均产生针对H1N1 型HI 抗体，配伍1、2、3 组HI 效价GMT 分别为1 ∶184、1 ∶243 和1 ∶184，各组GMT 增长倍数在24.25 ～ 48.50 之间；配伍2 组的HI 效价和GMT增长倍数均明显高于阴性对照组，且差异有统计学意义（F =2.970，P =0.018 7）；各组HI 抗体效价阳转率均达100%。见表1。

图2 融合蛋白FP 的Western blot 分析Fig.2 Western blotting of FP

表1 各组小鼠H1N1 型毒株HI 抗体效价Tab.1 HI antibody titers against H1N1 virus strain

2.4 H 3N 2 型H I抗体效价 QIV 免疫前，所有小鼠均未检出HI 抗体。QIV 免疫后，各组均产生针对H3N2 型HI 抗体，配伍1、2、3 组HI 效价GMT 分别为1 ∶35、1 ∶53 和1 ∶35；各组GMT 增长倍数在5.28 ～ 10.56 之间，配伍2 组高于阴性对照组，但差异无统计学意义（F =2.086，P =0.050 6）；各组在QIV 免疫后HI 抗体阳转率均有所上升，其中配伍2 组阳转率达100%，明显高于阴性对照组，且差异有统计学意义（χ2=4.285 7，P =0.000 2）。见表2。

表2 各组小鼠H3N2 型毒株HI 抗体效价Tab.2 HI antibody titers against H3N2 virus strain

2.5 B／V 型H I抗体效价 QIV 免疫前，所有小鼠均未检出HI 抗体。QIV 免疫后，各组均产生针对B ／ V 型HI 抗体，配伍1、2、3 组HI 效价GMT 分别为1 ∶61、1 ∶61 和1 ∶46；各组GMT 增长倍数在8.8～12.8 之间；HI 抗体效价阳转率在80% ～ 100%之间，组间比较差异无统计学意义（F =1.258，P =0.322 2）。见表3。

表3 各组小鼠B ／ V 型毒株HI 抗体效价Tab.3 HI antibody titers against B ／ V virus strain

2.6 B／Y 型H I抗体效价 QIV 免疫前，所有小鼠均未检出HI 抗体。QIV 免疫后，各组均产生针对B ／ Y型HI 抗体，配伍1、2、3 组HI 效价GMT 分别为1 ∶121、1 ∶121 和1 ∶92；各组GMT 增长倍数在14.25 ～22.63 之间，组间比较差异无统计学意义（F =1.107，P =0.380 6）；各组HI 抗体效价阳转率均达100%。见表4。

表4 各组小鼠B ／ Y 型毒株HI 抗体效价Tab.4 HI antibody titers against B ／ Y virus strain

2.7 非同源株H 3N 2 型H I抗体效价 QIV 免疫前，所有小鼠均未检出HI 抗体。QIV 免疫后，各组均产生针对H3N2 型HI 抗体，HI 效价GMT、GMT 增长倍数各组之间差异均无统计学意义（F =1.600，P =0.213 2）。见表5。

2.8 两株H 3N 2 型H A IgG ELISA 检测结果显示，配伍2 组小鼠血清中同源株H3N2 型HA IgG 抗体滴度增长倍数明显高于阴性对照和其余各组，且差异有统计学意义（F =166.7，P＜0.000 1）。非同源株检测结果显示，配伍2 组明显高于阴性对照和配伍1 组，且差异有统计学意义（F=25.37，P＜0.000 1和=0.003 5）；高于抗原组和配伍3 组，但差异无统计学意义（F =25.37，P分别为0.052 6 和0.051）。非同源株HA IgG 增长趋势与HI 抗体滴度结果（表5）不完全一致。见表6。

表5 各组小鼠H3N2 型毒株HI 抗体效价Tab.5 HI antibody titers against H3N2 virus strain

表6 H3N2 型毒株HA IgG 增长倍数Tab.6 Increasing fold of HA IgG titer against H3N2 virus strain

3 讨 论

本研究选择3 种已上市或多次用于人体临床研究的佐剂氢氧化铝、PolyIC + 氢氧化铝和阳离子佐剂，用于辅佐流感病毒抗原表位融合蛋白。铝佐剂最早批准用于人体，也是目前应用最广泛的无机盐佐剂，有不少于10 种疫苗含有铝佐剂［8］。PolyIC 作为TLR3 的配体佐剂，具有强效激活先天免疫的优势，以PolyIC 为主要成分的PIKA 佐剂用于狂犬病疫苗的临床研究显示，其可加速疫苗达到有效标准（抗体不低于0.5 IU ／ mL）［9］。阳离子佐剂系统二甲基双十八烷基铵／ 海藻糖6，6，9-二山嵛酸酯在小鼠体内可诱导高效的黏膜免疫和全身抗体反应［10］，人体临床研究表明，该佐剂还可激发强有力的T 细胞免疫应答［11］。

传统流感疫苗的免疫保护效果依据HI 抗体结果判断，而新型流感疫苗涉及更多的细胞免疫途径，现有的流感疫苗有效性评价标准无法适用。本研究在抗原和佐剂初次免疫后，使用QIV 加强免疫，通过检测小鼠血清HI 抗体效价或HA IgG 抗体水平判断其免疫原性，结果显示，佐剂与抗原本身并不产生针对任何型别的HI 抗体；抗原+ 阳离子佐剂+ QIV免疫后，显著提高了QIV 同源株H1N1 和H3N2 型HI 抗体效价或阳转率，且可促进非同源的H3N2 型HA IgG 抗体产生，但试验组血清并未显示出明显的非同源株的HI 抗体升高，HA IgG 抗体增长趋势与HI 抗体滴度并不一致。根据文献报道［12］，针对非同源株交叉保护可见HA IgG 抗体的增加，但无法通过HI 抗体结果反映。本研究中，HA IgG 抗体的增加是否与交叉保护有关，尚需通过进一步实验确认。

综上所述，本研究结果表明，阳离子佐剂辅助流感病毒抗原表位融合蛋白免疫小鼠后，可显著增强季节性流感疫苗甲型毒株的免疫原性，为后期新型流感疫苗的研制提供了参考。