南昌白猪大肠杆菌的分离鉴定及体外抑菌试验

李欢，黄婧文，梁润利，万乐，吴晨晓，张羿洋，肖芬，万振鹏，朱芝秀

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

大肠杆菌普遍存在于人和动物的肠道内，是一种常见的人畜共患病条件型致病菌[1]，某些血清型致病性的大肠杆菌及其毒素可引起的白猪大肠杆菌病[2],是危害仔猪生长发育的主要疫病之一[3],该病主要表现为肠系膜淋巴结肿大、充血；心、肝、肾有不同程度的变性和小的凝固性坏死灶[4]。2020 年10月，江西省某养猪场一头白猪因腹泻死亡。对疑似大肠杆菌感染的病例进行临床解剖。对从病变内脏中分离出的细菌进行鉴定和体外抑菌试验，探讨对该病有效的防治方法

1 材料

1.1 病料和试验动物

病料：江西省某猪场患病死亡猪。实验小白鼠：20g 左右，南昌大学动物养殖室提供。

1.2 试验试剂及器材

NA 培养基、EMB 培养基、MACC 培养基、TSI 培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；5%兔血培养基，自行配制；药敏试纸、肠杆菌生化鉴定微量管，购自杭州天和微生物有限公司；牛津杯，购自上海申源科学仪器有限公司；数显游标卡尺，购自上海上工仪器有限公司；超净工作台，购自苏州净化集团。

1.3 试验用菌

乳酸菌 T-C-7-R1、T-C-7-R2、T-C-7-R3：江西农业大学预防兽医实验室保存。

2 方法

2.1 细菌分离鉴定

2.1.1 临床诊断。观察心、肺、肝器官的病变情况；观察肠系膜淋巴结、各肠段的病变情况。截取脾脏、肺、小肠等器官的病变部位进行瑞氏染色镜检。

2.1.2 分离培养。从猪脾脏、小肠、肺等病变部位中勾取病料，接种于5%的兔血平板，37℃培养24h后，筛选单个菌落进行革兰氏染色镜检，察看细菌在油镜下的整体外形；纯化接种在普通琼脂培养基上,获得分离菌 D2、D3、D4；将 D2、D3、D4 进行鉴别培养，分别在EMB 培养基、麦康凯培养基、TSI 琼脂斜面培养基上划线接种后于37℃培养24h，观察菌落形态。

2.1.3 生化鉴定。将D2、D3、D4 分别接种于肠杆菌科的生化鉴定微量管中，37℃培养24～48h，观察反应，加入生化反应指示剂。对结果进行记录和分析。

2.2 体外抑菌试验

2.2.1 药敏试验。依据纸片扩散法[5]，无菌操作将D2、D3、D4 接种于普通肉汤中，37℃培养 24h，将发酵液均匀涂布于EMB 培养基上，药敏纸片按序贴于培养基表面，记录药敏纸片药物名称，在37℃恒温箱中静置24h，观察并记录结果，游标卡尺测量抑菌圈的直径。

2.2.2 乳酸菌体外抑菌试验。按照牛津杯扩散法，无菌条件下将 D2、D3、D4 接种普通肉汤，37℃静置培养24h，均匀涂抹于EMB 培养基表面，等距将牛津杯放置在平板上，将T-C-7 培养液用注射器缓慢注入牛津杯，置4℃冰箱待乳酸菌全部扩散后，正放于37℃温箱培养24h 后，测量记录抑菌圈大小。

2.3 动物试验

无菌条件下，将D2、D3、D4 接种于普通肉汤，37℃培养24h 备用。将适应环境一周后的实验小白鼠随机分为4 组（4 只/组）。3 组试验组分别腹部注射 D2、D3、D4 发酵液（0.5mL/只），1 组对照组用同样方式注射等量生理盐水。每天观察记录小白鼠的发病情况，具备典型病状的死亡小白鼠进行细菌分离鉴定。

3 结果

3.1 临床诊断结果

肺纤维素渗出（图1），腹股沟淋巴结大理石样变（图2），肠淋巴结肿大（图3），取猪肺病变部位进行瑞氏染色油镜观察，为两端钝圆的直杆型菌（图4）。

3.2 分离培养结果

图1 肺纤维素渗出

图2 腹股沟淋巴结大理石样

图3 肠淋巴结肿大

图4 瑞氏染色结果

D2、D3、D4 菌落在5%兔血平板上中等大小不溶血，EMB 培养基上闪现金属光泽（图5），麦康凯培养基上呈粉红色（图6）；TSI 斜面培养基无黑色沉淀（图7），经过革兰染色镜检，为G- 直杆菌（图8）。

图5EMB 菌落

图6 麦康凯菌落

图 7TSI 琼脂

图 8 染色结果（10×100）

3.3 生化鉴定结果

D2、D3、D4 生化结果见表1，分离菌靛基质试验呈阳性；发酵木糖产酸产气，不能分解棉子糖和侧金盏花醇，MR 阳性，VP 阴性。

表1 生化试验结果

3.4 药敏试验结果

药敏试验结果见表2，对头孢曲松高度敏感，对氨苄西林等完全耐药。

表2 药敏试验结果 mm

3.5 乳酸菌抑菌试验结果

抑菌试验结果见表 3，乳酸菌对 D2、D3、D4 有明显的抑制效果

表3 乳酸菌体外抑菌实验结果 mm

3.6 动物致病性试验

试验组小白鼠一周之内，出现拉稀的现象，体型逐渐消瘦。对照组的生理状态正常。分离典型病变小鼠肝脏中的病原菌，染色镜检结果与原分离菌形态一致。

4 分析讨论

4.1 菌种分析

根据D2、D3、D4 的培养特点、镜检结果和生化特性，通过比对《Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology》[6]，确定 D2、D3、D4 为大肠埃希氏菌。

4.2 临床症状和生化特性

本次病例临床诊断结果与病理解剖结果与姚淑红报道的大肠杆菌病临床诊断一致[7]，D2、D3、D4生化特性与徐海生发表的实验结果一致[8]。

4.3 体外抑菌试验分析

分析药敏试验结果可知，分离菌对头孢曲松高敏，但对氨苄西林等耐药[9]，与孙晓莉，陈敏卿等发表的论文结果有部分不符[10～11]，可能是地区用药习惯不同造成[12]。体外抑菌试验结果证明乳酸菌对大肠杆菌有较强的抑制作用，与易力、陆克文等发表的论文结果一致[13～14]，乳酸菌可配合抗生素使用[15]。

近年来我国养猪业的规模化发展,白猪大肠杆菌的发生与流行有明显增加的趋势[16]。养殖场应该加强防范，科学管理，以防范为主，定时消毒、通风，保证猪场的卫生良好。治疗可用肌肉注射头孢类抗生素并饲料中添加的乳酸菌配合以增强疗效。一旦发现病猪应立即隔离，谨防传染。