仔猪溶血性葡萄球菌的分离鉴定及体外抑菌试验分析

黄婧文，李欢，万振鹏，肖芬，张羿洋，吴晨晓，万乐，梁润利，朱芝秀

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

葡萄球菌是一种圆形或卵圆形的革兰氏阳性球菌，呈葡萄状，无鞭毛，无荚膜，不产生芽孢[1]。临床上，葡萄球菌病主要是由金黄色葡萄球菌引起的家畜的一种急性或慢性传染病[2～3]，表现为畜禽急性、败血性的一类疾病[4]，牛鸡鸭猪兔等均有可能感染该病[5～9]，发病急且迅速，并造成畜禽短时间内死亡[3]。2020 年 10～11 月间，南昌某猪场爆发疑似葡萄球菌病例，本试验旨在通过对疑似病例进行病理剖解及细菌分离鉴定等操作，对仔猪溶血性葡萄球菌的防治提供有效建议与科学方法。

1 试验材料

1.1 病料和试验动物

病料：江西省某猪场患病死亡仔猪；小白鼠：南昌大学动物室提供。

1.2 实验试剂及器材

普通琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；药敏试纸、微量发酵管，购自杭州天和微生物有限公司；牛津杯，购自上海申源科学仪器有限公司；数显游标卡尺，购自上海上工仪器有限公司；超净工作台，购自苏州净化集团

1.3 实验用菌

乳酸菌：由江西农业大学预防兽医教研室提供。

2 试验方法

2.1 细菌分离鉴定

2.1.1 病理检查。临床解剖：观察皮肤、黏膜等组织出血情况；观察心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等器官病变情况。

2.1.2 细菌分离培养。无菌操作取死亡猪心、肝、关节液等病料，划线接种5%兔血平板，置37℃温箱培养24h，观察优势菌落形态、大小、溶血等状况；接种环无菌勾取单个典型菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态及排列状况；勾取镜检菌落再次接种5%兔血平板，直至得到纯分离菌ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3。

2.1.3 细菌生化鉴定。将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 分别接种于生化微量管中，于37℃培养24 ～48 h，根据微量生化反应说明书，观察反应变化，分析并记录结果。

2.2 细菌体外抑菌试验

2.2.1 药敏试验。依据纸片扩散法[11]，在无菌条件下，将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接种于普通肉汤中，置于37℃恒温培养 24h 后，将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 发酵液涂抹普通琼脂培养基表面，用眼科镊夹取药敏纸片分别轻贴涂抹后的培养基，记录药敏纸片名称及放置顺序，37℃静置培养24h，观察抑菌情况，游标卡尺测量抑菌圈直径。

2.2.2 乳酸菌对分离菌体外抑制试验。在无菌条件下，将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接种于普通肉汤中，37℃静置培养 24h。将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3发酵液均匀涂布普通琼脂平板，其上等距离放置牛津杯，将乳酸菌培养液缓慢注入牛津杯，置4℃冰箱扩散过夜后，于37℃培养24h，测量抑菌圈大小。

2.3 动物致病性试验

在无菌条件下，将 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接种于普通肉汤，37℃培养24h 备用。待小白鼠适应一周后，随机分为4 组（4 只/组）。3 组试验组分别腹注射 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 发酵液（0.5mL/只），1组对照组同样方式注射等量生理盐水。每日观察记录小白鼠的发病情况，对具有典型病状的小白鼠进行细菌分离培养。

3 结果

3.1 临床检查结果

肠系膜出血，淋巴结肿大（图1）；胃内外膜出血（图 2）；关节积液明显（图 3）；肺水肿、出血（图 4）；心肌出血（图 5）；肝、胆囊出血（图6）。

图1 肠系膜出血、淋巴结肿大

图2 胃内外膜出血

图3 关节积液

图4 肺水肿、出血

图5 心肌出血

图6 肝、胆囊出血

3.2 病原菌分离培养结果

ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 菌落在 5%兔血平板上均呈透明的β 溶血（图7），经革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状（图8）。

图7 透明的β 溶血

图8 革兰氏阳性球菌

3.3 细菌生化试验结果

由表 1 可知：ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 可分解葡萄糖等五主糖，均产酸不产气。

表1 分离菌生化特性

3.4 分离菌药敏试验结果

由表 2 可知，ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 对头孢曲松、头孢唑啉高度敏感，对链霉素、甲氧嘧啶、强力霉素、乙酰螺旋霉素等耐药。

表2 药敏试验结果 mm

3.5 乳酸菌对分离菌体外抑制试验结果

乳酸菌 T-12C-5、T-12C-7、T-12C-11 对 ZGP-1、ZGP-2 抑制作用不明显，但对ZGP-3 有明显抑制作用。

表3 乳酸菌对分离菌体外抑制试验结果 mm

3.6 动物致病性结果

试验组小白鼠一周之内，体形逐渐消瘦，腹部均有皮肤溃烂，呈现化脓性炎症。对照组生理状态正常。从典型病变小鼠肝脏中，分离到形态一致的细菌，染色镜检结果与原分离菌一致，均为葡萄状革兰氏阳性球菌。

4 讨论

4.1 菌种分析

比对病理剖检、培养特性、生化试验等结果，参照《伯杰氏细菌分离鉴定手册》[11]，可确诊3 株分离菌均为金黄色葡萄球菌。

4.2 临床症状分析

分离菌临床剖解结果与林丽萍等发表的论文部分一致[12]，都引起关节炎、心内膜炎等症状。

4.3 生化试验分析

生化反应结果与刘金章报道的病例基本相同[13]，vp 试验结果与王光锋报道的病例不同[14]，可能与菌株差异有关。

4.4 体外抑菌试验分析

药敏试验结果表明，分离菌对头孢曲松、头孢唑啉高敏，对链霉素、强力霉素、环丙沙星、林可霉素等耐药，与李淑红[15]、蒋文贤等发表的论文结果不符[16]，可能与各地区用药习惯有关。

乳酸菌体外抑菌结果表明，乳酸菌对分离菌均有一定的抑制作用，与彭珍发表的论文结果一致[17]，但对ZGP-1、ZGP-2 抑制作用不明显，对ZGP-3 有明显抑制作用，这可能是试验操作失误造成的，比如培养基厚度、干湿不同，引起乳酸菌扩散不均，造成抑菌圈大小悬殊。

4.5 动物致病性试验

试验小白鼠腹部皮肤均出现化脓性炎症，怀疑分离菌是由于仔猪相互攻击，从皮肤伤口入侵并致病，也可能存在耐药基因引起多发。

5 防控措施

随着畜牧业的快速发展，金黄色葡萄球菌病作为一种易发病应当得到重视。养殖场应加强饲养管理，保持圈舍卫生，定期进行消毒，做好免疫预防。一旦发现发病个体，应立即隔离，圈舍消毒，防止更大范围的感染。同时,由于各种抗生素在猪场广泛应用，导致金黄色葡萄球菌耐药性污染逐年增加,致使金黄色葡萄球菌导致的病害预防和治疗难度加大[16]，在用药方面可采用头孢曲松等高敏药物配合乳酸菌使用，追求合理配药，避免长期使用某一种抗菌药物,遵循交叉用药、轮换用药和配伍用药的原则,警惕抗生素的滥用现象[18]。