柚皮苷通过调节小胶质细胞极化对APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠的认知功能影响

王 贝 赵雨航 王乐伟 潘顺基 石 见 王冬梅∗

(1.河南科技大学医学院,河南洛阳 471023;2.杭州医学院,杭州 310051;3.河南科技大学第一附属医院,河南洛阳 471023)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性变性疾病,其临床表现以进行性、退行性大脑认知,识别功能障碍为特征,明显记忆力降低并伴随个性和行为的改变[1-4]。AD 环境下Aβ 寡聚体持续激活小胶质细胞产生大量炎症因子和神经毒性炎症因子,促使小胶质细胞对突触过度吞噬和清除,引起突触损伤和认知障碍[5]。多项研究表明,小胶质细胞过度激活以及M1/M2 型极化失衡,在AD 发生发展中发挥重要作用[6]。

二氢黄酮柚皮苷(naringin)具有抗炎、降脂和抗氧化等多种药理作用的药物[7]。柚皮苷在预防和治疗神经退行性疾病方面具有良好的中枢神经系统渗透性和显著的治疗效果[8]。研究发现柚皮苷能够缓解硝基丙酸诱导的大鼠亨廷顿症的行为异常[9],改善红藻氨酸毒性引起的神经行为[10]。柚皮苷通过抑制胶质细胞激活和神经炎症,对脑缺血再灌注损伤[11]以及LPS 诱导的神经炎症相关的脑损伤具有显著的神经保护作用[12]。我们前期研究报道100 mg/kg 柚皮苷能够缓解APPswe/PS1dE9 小鼠空间学习记忆能力[13],AD 环境下,柚皮苷对小胶质细胞表型转换以及其吞噬功能的调节,至今未见报道。本文将探究AD 模型中柚皮苷对小胶质细胞的极化调节效应,以及该效应对认知功能的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3 月龄清洁级APPswe/PS1dE9 转基因雄性小鼠20 只,体重20～25 g;清洁级同窝非转基因C57BL/6J 雄性小鼠20 只,体重20～25 g,均购自北京华阜康公司[SCXK(京)2019-0008],所有实验小鼠饲养于武汉赛维尔生物科技有限公司[SYXK(鄂)2018-0101],饲养温度18℃～22℃,光照12 h,相对湿度50%～60%,自由摄食饮水。本研究过程的所有操作符合本院动物伦理学的标准和要求(2019-03011),并按3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

柚皮苷购自美国Selleck 公司(CAS:10236-47-2;货号:S2329);兔抗IbA-1 抗体购自Abcam 公司(货号:ab178846);鼠抗Aβ 抗体购自CST 公司(货号:15126);荧光二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 均购自美国Proteintech Group 公司(货号:SA00006-2,SA00006-3);PCR 引物从上海生工订购;cDNA 合成试剂盒和q-PCR 试剂盒购自碧云天生物技术公司(货号:D7170,D7260);TB(总胆红素)、ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天冬氨酸转氨酶)、Cr(肌酐)、BUN(尿素氮)ELISA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(货号:C019-1-1,C009-2-1,C010-2-1,C011-2-1,C013-2-1);PCR 仪(Effendorf);凝胶图像分析系统(Tannon);Leica 冰冻切片机(德国Leica公司);荧光显微镜(Olympus,日本);酶标仪(美国伯乐公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及处理

3 月龄APPswe/PS1dE9 转基因雄性小鼠作为模型组(APPswe/PS1dE9) 和治疗组(APPswe/PS1dE9+柚皮苷100 mg/(kg·d)),并选择同窝非转基因小鼠作为对照组和柚皮苷单独给药组(柚皮苷100 mg/(kg·d)),这些小鼠年龄体重匹配。对照组及模型组小鼠给予常规的标准鼠粮,柚皮苷治疗组和柚皮苷单独给药组在常规的标准鼠粮中加入100 mg/(kg·d)的柚皮苷治疗16 周,进行后续实验。

1.3.2 新物体识别实验

实验是在一个边长为40 cm×40 cm×40 cm 白色不透明的亚克力材料场地中进行的,实验期间保持安静;第1 天为适应期,第2 天为熟悉期:箱内一端放入两个颜色材料完全相同的物体(边长为3 cm的立方体),距物体等距离处将小鼠放入箱内并熟悉5 min。熟悉期4 h 之后为测试期:将箱内的一个物体替换成形状和颜色不同的物体(直径、高均为3 cm),位置不变,小鼠放入箱内并由箱体上方的摄像机记录小鼠5 min 内对新、旧两个不同物体的探究时间TN 和TF。小鼠对物体的识别能力应用识别指数(discrimination index,DI)表示,计算公式为:DI=(TN-TF)/(TN+TF)×100%。

1.3.3 实时荧光定量PCR 实验

将样本彻底研碎,根据试剂盒说明书使用TRIzol 法对样品进行RNA 提取,用紫外吸收法对提取的RNA 进行纯度和浓度的测定,利用碧云天公司试剂盒反转录成cDNA,以cDNA 为模板,对管家基因和目的基因进行扩增,反应条件:95℃预变性2 min,95℃变性15 s,60℃退火15 s,60℃延伸30 s,40个循环;对各个样本进行重复实验并分析结果。引物序列见表1。

1.3.4 免疫荧光实验

预冷的4%多聚甲醛心脏灌注取脑,浸泡过夜后,30%蔗糖溶液沉糖,包埋后,-20℃快速冠状连续切片(20 μm),取脑片,封闭1 h,弃去封闭液,一抗4℃过夜,复温,PBS 漂洗3 次,每次5 min,荧光标记二抗,室温1 h,PBS 漂洗3 次,每次5 min,DAPI 染色5 min,PBS 漂洗3 次,抗荧光淬灭剂封片,拍照,Image J 分析特定区域平均荧光强度。

1.3.5 生化指标检测

待行为学实验结束后,动物禁食6 h,采用眼眶取血法,根据试剂说明书操作,检测血清中的TB,ALT,AST,Cr,BUN。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 分析软件进行统计学分析,实验结果数据均以平均数±标准差()表示。组间比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时采用LSD 法,方差不齐者采用Dunnett 检验,以P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 柚皮苷对APP/PS1 模型小鼠认知功能的影响

新物体识别实验是评估动物非空间工作记忆能力的行为学实验方法;本实验治疗组分为柚皮苷低剂量(50 mg/(kg·d)),高剂量(100 mg/(kg·d)),实验结果显示,与模型组相比,低剂量治疗组小鼠识别指数无明显差异(P>0.05),而高剂量治疗组小鼠识别指数明显增加(P<0.05),因此,本研究采用高剂量柚皮苷(100 mg/(kg·d))进行后续实验。表2 结果所示,与对照组相比,模型组小鼠识别指数显著降低(P<0.05),而柚皮苷(100 mg/(kg·d))治疗能够显著增加模型组小鼠的识别指数(P<0.05),结果提示柚皮苷(100 mg/(kg·d))能够缓解模型组小鼠的认知功能障碍。

2.2 柚皮苷对CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 和CD206,TGF-β,Arg1,YM-1 以上标记物mRNA 的影响

如图1 所示,与对照组相比,模型组小鼠脑组织M1 标记物(CD16、TNF-α、iNOS、MCP-1)mRNA 表达水平均显著增加(P<0.05),而M2 型标记物(CD206、TGF-β、Arg1、YM-1)mRNA 表达均显著降低(P<0.05),表明模型组小鼠脑组织中,活化的小胶质细胞主要为M1 促炎表型;与模型组相比,柚皮苷治疗的APPswe/PS1dE9 小鼠,活化的小胶质细胞主要为M2 抗炎表型。

表2 柚皮苷对APPswe/PS1dE9 模型小鼠认知功能的影响(,n=10)Table 2 Effects of naringin on the cognitive function of APPswe/PS1dE9 model mice

表2 柚皮苷对APPswe/PS1dE9 模型小鼠认知功能的影响(,n=10)Table 2 Effects of naringin on the cognitive function of APPswe/PS1dE9 model mice

注:与对照组相比较,#P<0.05;与模型组相比较,∗P <0.05。Note.Compared with control group,#P <0.05.Compared with model group,∗P <0.05.

2.3 柚皮苷通过调节小胶质细胞极化促进对Aβ的吞噬和清除

小鼠大脑冠状切面免疫荧光结果显示,与模型组相比,柚皮苷治疗组小鼠皮层和海马区域内围绕及吞噬Aβ 的小胶质细胞增加了76.3%。结果提示柚皮苷促进了小胶质细胞对Aβ 的吞噬。见图2。

2.4 柚皮苷抑制APPswe/PS1dE9 模型小鼠脑组织Aβ 的聚集和沉积

荧光结果分析数据显示,与模型组相比,柚皮苷治疗的APPswe/PS1dE9 小鼠海马区域Aβ 荧光强度降低了35.7%,免疫阳性面积减少了46.9%;皮层区域Aβ 荧光强度降低了41.5%,阳性面积减少了57.3%。见图3。

2.5 柚皮苷对小鼠肝肾功能的影响

表3 结果显示,对照组和模型组小鼠肝肾功能各参数值无显著性差异(P>0.05)。柚皮苷100 mg/(kg·d)给药16 周后,各参数值与对照组和模型组相比均无显著性差异(P>0.05),表明柚皮苷100 mg/(kg·d)持续给药16 周后对小鼠肝肾功能无明显影响。

图1 柚皮苷对CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 和CD206,TGF-β,Arg1,YM-1 以上标记物mRNA 的影响Note.Four groups of bars in the figure show the mRNA content of various markers in the brain tissues of mice.Compared with control group,∗P<0.05,∗∗P <0.01.Compared with model group,#P <0.05,##P<0.01.Figure 1 Effects of naringin on mRNA levels of CD16,TNF-α,iNOS,MCP-1 and CD206,TGF-β,Arg1,YM-1

图2 APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar 组小鼠小胶质细胞和Aβ 斑块免疫荧光图Note.A,Microglial cells and Aβ plaque,using anti-Iba1(green) and anti-Aβ(red) immunofluorescence staining images.B,Quantitative analysis of microglia within 20 μm of amyloid plaque (n=90～100 amyloid plaque/group).Compared with model group,∗P<0.05,∗∗P <0.01.Figure 2 Immunofluorescence of microglia cells and Aβ plaque in APPswe/PS1dE9 and APPswe/PS1dE9+Nar mice groups

图3 Control、APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar 组小鼠脑组织Aβ 免疫荧光染色Note.A,Hippocampus and cortex Aβ immunofluorescence staining.B,Aβ immunofluorescence intensity and area analysis.Compared with model group,∗P <0.05,∗∗P <0.01.Figure 3 Aβ immunofluorescence staining of mouse brain tissue in Control、APPswe/PS1dE9、APPswe/PS1dE9+Nar groups

表3 各组小鼠肝肾功能指标(,n=10)Table 3 Liver and kidney function indexes of mice in each group

表3 各组小鼠肝肾功能指标(,n=10)Table 3 Liver and kidney function indexes of mice in each group

注:TB:总胆红素;ALT:丙氨酸转氨酶;AST:天冬氨酸转氨酶;Cr:肌酐;BUN:尿素氮。与对照组相比,#P >0.05。Note.TB,Total bilirubin.ALT,Alanine aminotransferase.AST,Aspartate aminotransferase.Cr,Creatinine.BUN,Urea nitrogen.Compared with control group,#P >0.05.

3 讨论

小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞,在神经细胞自噬与凋亡、突触清除与修剪、神经可塑性和学习认知等方面发挥重要作用,小胶质细胞的激活状态分为M1 型(促炎)和M2 型(抗炎)[14-18]。在AD 患者和AD 动物模型脑组织中,小胶质细胞过度激活,并且向M1 型极化[6]。与此相一致,我们的研究中发现APPswe/PS1dE9 模型小鼠脑组织M1型标志物显著增加,M2 型小胶质细胞标志物显著降低,小胶质细胞向M1 型极化。过度活化的M1 型细胞释放分泌高水平的促炎因子及细胞毒性物质,进一步加重神经炎症介导的神经毒性,在死亡神经元和急性炎症之间建立一个恶性循环[19]。多项研究显示,通过调控小胶质细胞的亚型分化,促进小胶质细胞向抗炎的M2 型转化,能够缓解AD 患者和AD 实验动物的认知功能损伤[6]。柚皮苷具有抗炎和免疫调节功能,本研究发现柚皮苷能够降低M1型小胶质细胞标记物的表达,增加M2 型小胶质细胞标记物的表达,调控活化的小胶质细胞由M1 向M2 型极化。

研究表明Aβ 异常沉积和聚集能够触发神经毒性和神经炎症,诱导神经退行性病变,在AD 发生发展中发挥关键作用[18-20]。我们前期的研究发现,100 mg/kg 柚皮苷治疗能够抑制APPswe/PS1dE9模型小鼠脑组织Aβ 的生成[13]。为了研究柚皮苷对Aβ 的清除作用,本研究通过免疫荧光共染小胶质细胞和Aβ 检测小胶质细胞对Aβ 的吞噬作用,结果显示,与模型组相比,柚皮苷治疗组小鼠皮层和海马区域围绕及侵噬老年斑的小胶质细胞显著增加,表明柚皮苷促进小胶质细胞对Aβ 的吞噬。为了进一步验证柚皮苷对Aβ 聚集和沉积的抑制作用,我们采用免疫荧光染色观察小鼠脑内的老年斑,结果显示,柚皮苷显著减少APPswe/PS1dE9 模型小鼠大脑皮层和海马老年斑的面积。柚皮苷通过调节小胶质极化从而促进了Aβ 的吞噬和清除,并有效抑制脑组织内Aβ 的聚集和沉积。而抑制Aβ 的生成以及促进Aβ 的清除,能够显著改善AD行为学异常。

新物体识别实验(novel objective recognition,NOR)是评估内嗅皮层和海马功能依赖的非空间短期工作记忆能力[21]。NOR 实验是检测实验动物在自由活动状态下的学习记忆能力,显著优于电刺激下检测实验动物非空间短期记忆的避暗实验和跳台实验。我们之前研究报道100 mg/(kg·d)的柚皮苷能够显著缓解APPswe/PS1dE9 模型小鼠在避暗实验的空间记忆能力[13],与此相一致,本研究发现,柚皮苷能够促进APPswe/PS1dE9 模型小鼠的非空间短期工作记忆能力,提示内嗅皮层和海马功能的改善。

在AD 治疗中,中药单体具有靶点明确,特异性强等显著优势,但随着剂量的增加,通常伴随着明显的肝肾毒副作用。为了探究100 mg/(kg·d)的柚皮苷给药16 周后对小鼠是否有肝肾毒副作用,我们选择临床和实验研究中常用的中药肝肾毒性损伤指标,用于评价各组小鼠的肝肾功能状况,结果显示各组小鼠肝肾功能无显著差异。

综上,柚皮苷通过调节小胶质细胞由M1 型向M2 型极化,增强小胶质细胞对Aβ 的吞噬,抑制Aβ的聚集和沉积,进而缓解APPswe/PS1dE9 模型小鼠的非空间短期工作记忆能力,并且100 mg/(kg·d)的柚皮苷对小鼠无肝肾毒性。