西维来司钠对COPD 大鼠GRP78/PERK/CHOP信号通路及气道高分泌的影响

王生成 李 琪 蔡潇阳 唐咏婕

(1.儋州市人民医院呼吸内科,海南儋州 571700;2.海南医学院第一附属医院呼吸内科,海口 570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种临床常见呼吸系统疾病,好发于老年人,随着我国老龄化人口加剧,COPD 发病率呈逐渐增加趋势,严重威胁老年人的身体健康及生活质量,并给家庭及社会带来严重经济负担[1-2]。西维来司钠(sivelestat sodium)又名ONO-5046,是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)抑制剂,可选择性抑制弹性蛋白酶,抑制肺泡上皮炎性因子释放及黏液分泌,减轻肺损伤[3-4]。气道黏液高分泌是COPD 主要病理生理特征,是影响疾病进展及预后的独立危险因素,其在COPD 发病中的作用成为近来研究热点之一[5]。葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein,GRP)78/蛋白激酶R 样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/CCAAT

增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)信号通路是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的细胞凋亡一种重要途径,ERS 与COPD 肺上皮细胞凋亡、气道黏液分泌密切相关[6-7]。但西维来司钠减轻COPD 气道黏液高分泌是否与GRP78/PERK/CHOP 信号通路有关尚未见相关报道。本研究通过建立COPD 大鼠模型,拟初步探究不同浓度西维来司钠对COPD 大鼠气道高分泌及GRP78/PERK/CHOP 信号通路的影响,以期揭示其作用机制,为寻找COPD 气道黏液高分泌的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级6 周龄雄性SD 大鼠60 只,体重210～230 g,购自南京君科生物工程有限公司[SCXK(苏)2017-0005],动物饲养在南京君科生物工程有限公司[SYXK(苏)2017-0033]。本研究符合动物伦理学3R 原则,实验经过儋州市人民医院伦理委员会批准(IACUC20180901-02)。

1.2 主要试剂与仪器

西维来司钠(批号:S7198,纯度≥98%)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(批号:L2630)均购自美国Sigma-Aldrich 公司。

南京香烟(每支焦油含量8 mg、烟碱量0.8 mg、一氧化碳量7 mg)购自江苏中烟南京卷烟厂;RNA提取试剂盒(批号:R0011)购自上海碧云天有限公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒(批号:6210A)、TB Green©Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)实时荧光定量PCR 试剂盒(批号:RR820A)均购自日本TaKaRa 公司;黏蛋白5AC(MUC5AC)单克隆抗体(批号:ab24071)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78) 单克隆抗体(批号:ab21685)、蛋白激酶R 样内质网激酶(PERK)单克隆抗体(批号:ab79483)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)单克隆抗体(批号:ab179823)、GAPDH 单克隆抗体(批号:ab9485)、羊抗鼠IgG 二抗(批号:ab205719)均购自英国Abcam 公司。

动物肺功能仪(型号:PONYFX)购自意大利科时迈公司;光学显微镜(型号:DM3000)购自德国徕卡公司;荧光定量PCR 仪(型号:7500)购自美国Thermo Fisher 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 COPD 模型制备

根据参考文献[7]并结合预实验改良情况建立COPD 大鼠模型。自制50 cm×50 cm×30 cm 动物烟熏箱,每次放入12 只大鼠,于造模第2～7 天、9 d～14 d,点燃香烟使大鼠被动吸烟,每天1 次,每次12支(烟雾浓度1.41×103mg/cm3,CO 浓度1.12×103mg/cm3,氧浓度21%),每次30 min,烟熏区侧壁钻孔适当通风,以防大鼠CO 中毒。并分别于第1、8、15、21 天气管滴注LPS 200 μg(1 mg/mL)。刺激1周期后20 d 成模。

1.3.2 实验分组及给药

成模大鼠按照随机数字表法分为COPD 组及西维来司钠干预组(低、中、高剂量),另取正常饲养大鼠为对照组(NC 组),每组12 只。西维来司钠低、中、高剂量组分别于成模后第1 天起尾静脉注射西维来司钠2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg[8-9],NC 组、COPD 组注射等量生理盐水,每天2 次,连续干预21 d。

1.3.3 标本采集

干预结束后,腹腔注射麻醉处死大鼠,打开胸腔,暴露双肺,取出右肺,暴露气管,在气管下段作小T 型切口,插入钝钢针头,手术线固定,注射器注入8 mL 生理盐水,反复抽吸3 次回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),重复3 次,收集BALF 约8 mL,于3000 r/min,有效离心半径10 cm 离心10 min,留取上清分装,置-80℃冰箱中保存备用。另取部分右肺组织分别于4%多聚甲醛固定及液氮中保存备用。

1.3.4 肺功能指标检测

干预结束后,麻醉各组大鼠并进行固定,切开颈部皮肤,分离皮下组织,在气管肋骨间切口并插入接有三通的气管插管,缝合固定气管切口后将气管插管另一端介入动物肺功能仪,检测各组大鼠0.1 s 用力呼气量(0.1 s forced expiratory volume,FEV0.1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)水平。

1.3.5 肺组织病理学变化检测

于4%多聚甲醛固定的右肺组织进行石蜡包埋后,以4 μm 厚度连续切片,进行苏木素-伊红染色(HE 染色),于光镜下观察肺组织病理学改变。

1.3.6 大鼠肺泡上皮细胞凋亡检测

取大鼠肺组织石蜡切片,采用原位末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)检测各组大鼠肺上皮细胞凋亡情况,具体操作严格按照试剂盒说明书进行,随机选取5 个视野,于400 倍光镜下计数肺泡上皮细胞中凋亡细胞数取平均值。凋亡率=凋亡肺泡上皮细胞数/肺泡上皮总数×100%。

1.3.7 肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平检测

采用RNA 提取试剂盒提取肺组织总RNA,用紫外分光光度计检测总RNA 浓度及纯度(OD280/OD260:1.8～2.0)。反转录得到cDNA,置于-20℃保存备用。采用实时荧光定量 PCR (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)仪对肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 片段进行扩增。引物由上海碧云天有限公司合成,引物序列见表1。采用20 μL 反应体系:TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O 6 μL。反应条件:95℃30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40 个循环。采用2-ΔΔCT法对肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 相对表达水平进行定量分析。GAPDH 为内参基因。

1.3.8 肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达量检测

采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达。提取肺组织总蛋白,BCA 试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg 蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜至聚偏氟丙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,分别滴加一抗MUC5AC(稀释比1 ∶2000)、GRP78(稀释比1 ∶1000)、PERK(稀释比1∶1000)、CHOP(稀释比1 ∶1000)、GAPDH(稀释比1∶5000),4℃过夜,PBS 洗涤后添加羊抗鼠IgG 二抗(稀释比1 ∶10000),室温下封闭2 h,PBS 洗涤后使用化学发光增强法(ECL)发光试剂盒显影,分析各蛋白条带灰度值,以β-actin 为内参计算目的蛋白条带的相对比值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。实验数据以平均数±标准差()表示,多组数据比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能指标比较

与NC 组比较,COPD 组大鼠FEV0.1、FVC 水平显著降低(P<0.05);与COPD 组比较,西维来司钠低、中、高剂量组大鼠FEV0.1、FVC 水平依次升高(P<0.05),见表2。

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化情况

NC 组大鼠肺泡组织结构完整,无明显病理改变。COPD 组大鼠肺组织支气管壁增高,肺泡组织壁变薄,纤毛脱落、倒伏明显,有大量炎性细胞浸润。西维来司钠各干预组大鼠肺组织病理改变均减轻,见图1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 RT-qPCR primer

表2 各组大鼠肺功能指标FEV0.1、FVC 水平比较(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

表2 各组大鼠肺功能指标FEV0.1、FVC 水平比较(mL,n=12,)Table 2 Comparison of pulmonary function indexes FEV0.1 and FVC levels in each group

注:与NC 组比较,aP<0.05;与COPD 组比较,bP<0.05;与西维来司钠低剂量组比较,cP<0.05;与西维来司钠中剂量组比较,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.3 各组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率比较

与NC 组比较,COPD 组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与COPD 组比较,西维来司钠低、中、高剂量组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率依次降低(P<0.05),见表3。

图1 各组大鼠肺组织病理学变化(HE 染色)Figure 1 Pathological changes of lung tissue in each group(HE staining)

表3 各组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率比较(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

表3 各组大鼠肺泡上皮细胞凋亡率比较(n=12,)Table 3 Comparison of apoptosis rate of alveolar epithelial cells in each group

注:与NC 组比较,aP<0.05;与COPD 组比较,bP<0.05;与西维来司钠低剂量组比较,cP<0.05;与西维来司钠中剂量组比较,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

2.4 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平比较

与NC 组比较,COPD 组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 水平显著增加(P<0.05);与COPD 组比较,西维来司钠低、中、高剂量组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平依次降低(P<0.05),见表4。

2.5 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达量比较

与NC 组比较,COPD 组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白量显著增加(P<0.05);与COPD 组比较,西维来司钠低、中、高剂量组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达量依次降低(P<0.05),见表5、图2。

表4 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平比较(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

表4 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平比较(n=12,)Table 4 Comparison of expression levels of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP mRNA in lung tissues of rats in each group

注:与NC 组比较,aP<0.05;与COPD 组比较,bP<0.05;与西维来司钠低剂量组比较,cP<0.05;与西维来司钠中剂量组比较,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

表5 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达量比较(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

表5 各组大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达量比较(n=12,)Table 5 Comparison of MUC5AC,GRP78,PERK and CHOP protein expression in lung tissue of rats in each group

注:与NC 组比较,aP<0.05;与COPD 组比较,bP<0.05;与西维来司钠低剂量组比较,cP<0.05;与西维来司钠中剂量组比较,dP<0.05。Note.Compared with the NC group,aP<0.05.Compared with the COPD group,bP<0.05.Compared with the sivelestat sodium low dose group,cP<0.05.Compared with the sivelestat sodium middle dose group,dP<0.05.

图2 Western blot 检测大鼠肺组织MUC5AC、GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达Note.A,NC group.B,COPD group.C,Sivelestat sodium low dose group.D,Sivelestat sodium middle dose group.E,Sivelestat sodium high dose group.Figure 2 Western blot detection of MUC5AC,GRP78,PERK,CHOP protein expression in rat lung

3 讨论

COPD 是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病,气流受限进行性发展,与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关,其中烟草是COPD 重要致病原因,LPS 是一种细菌内毒素,二者联合刺激大鼠气道黏膜可激活多种炎症、应激信号通路,与气道黏液高分泌调控密切相关[10-12]。因此本研究采用烟熏结合LPS 刺激建立COPD 大鼠模型,结果发现,与NC 组比较,COPD 组大鼠肺组织支气管壁增高,肺泡组织壁变薄,纤毛脱落、倒伏明显,有大量炎性细胞浸润,FEV0.1、FVC 水平显著降低,符合COPD 典型临床特征,提示COPD 大鼠模型制备成功,可用于后续实验。

正常气道黏膜表面覆盖少量黏液,可保护气道、润滑上皮、防御外来刺激物和细菌等。气道黏液由杯状细胞、黏膜下腺体细胞及气道上皮细胞分泌,气道黏蛋白(mucoprotein,MUC)是气道黏液高分泌大分子的主要组成成分,是产生气道弹性与黏性的主要原因,其中MUC5AC 是支气管上皮产生的主要呼吸道MUC,在病理情况下可显著增加,其表达水平可代表气道黏液分泌强度[13-14]。西维来司钠是一种NE 抑制剂,可竞争性抑制中性粒细胞活化及浸润,减少自由基产生及释放,发挥抗炎、抗氧化等作用。本研究结果发现,与NC 组比较,COPD组大鼠肺组织MUC5AC mRNA 及蛋白量显著增加,提示COPD 大鼠存在气道黏液高分泌。而西维来司钠可呈剂量依赖性减轻大鼠肺组织病理学改变、改善肺功能及抑制MUC5AC mRNA 及蛋白表达,提示西维来司钠可能对COPD 大鼠气道黏液高分泌症状具有一定缓解及治疗作用,可能与抑制COPD 早期炎症反应有关[15-16]。

内质网广泛存在于真核细胞中,是蛋白质合成、折叠及Ca2+储存的主要场所。在毒物或氧化应激刺激等调解下,内质网内出现未折叠或错误折叠蛋白的积累和Ca2+平衡失衡,导致ERS[17]。适度ERS 有助于通过未折叠蛋白反应(protein response,UPR)促进蛋白质加工的恢复,而严重和持续的ERS可触发相关细胞的凋亡。GRP78/PERK/CHOP 信号通路是ERS 介导的一种重要细胞凋亡通路,ERS发生时,GRP78 表达升高,PERK 发生磷酸化,进而CHOP 表达增多,CHOP 蛋白是ERS 介导细胞凋亡程度的标志蛋白[18]。本研究结果发现,与NC 组比较,COPD 大鼠肺泡上皮细胞凋亡率、肺组织GRP78、PERK、CHOP mRNA 及蛋白量显著增加,而西维来司钠可呈剂量依赖性降低COPD 大鼠肺泡上皮细胞凋亡率、肺组织GRP78、PERK、CHOP mRNA及蛋白表达,可能因为气道上皮细胞在维系上皮结构完整性及功能中发挥重要作用,气道上皮损伤、凋亡和黏液高分泌会加重气道损害,促进疾病进展,提示西维来司钠可减轻气道黏液高分泌,可能与抑制GRP78/PERK/CHOP 信号通路激活,抑制COPD 肺组织上皮细胞凋亡有关[19-20]。

综上所述,西维来司钠可减轻COPD 大鼠气道黏液高分泌,可能与抑制GRP78/PERK/CHOP 信号通路激活,抑制COPD 肺组织上皮细胞凋亡有关。但关于西维来司钠减轻COPD 气道黏液高分泌机制是否还涉及其他炎症相关等通路共同参与,有待进一步深入探究。