芹菜素对妊娠期糖尿病大鼠内质网应激CHOP信号通路的影响

陈雪宁 黄 河 蔡志善 符大天 杨树博 张 蕾∗

(1.海口市妇幼保健院,海口 570102;2.海南省妇女儿童医学中心,海口 570100;3.海南医学院第一附属医院,海口 570102)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期间发现的以血糖升高为主要表现的代谢异常性疾病,其发病机制复杂,可导致胚胎发育不良、异常甚至死亡等不良妊娠结局[1-2]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)信号通路增强子结合(C/EBP)同源蛋白(CHOP)表达与GDM 患者胰岛细胞凋亡及胰腺组织损伤等病理过程密切相关[3-4]。芹菜素(apigenin,AP)是从蔬菜和水果中提取的天然黄酮类化合物,其具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等功效及毒性较低、无致癌致突变性等特点[5-7]。近年来研究发现,AP 可降低肝组织ERS 信号通路激活及肝组织损伤[8],但AP 对GDM 大鼠胰腺组织ERS 信号通路CHOP 蛋白表达的影响未见报导。本研究建立GDM 大鼠模型,对此进行探讨,以期为临床合理用药提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD 雌性大鼠80 只,雄性大鼠40 只,体重200～220 g,6～7 周龄,由广东省医学实验动物中心提供[SCXK(粤)2018-0002]。所有大鼠于海南省药物安全性评价研究中心动物实验室饲养[SYXK(琼)2017-0013],饲养条件:自然光照,自由饮食、饮水,温度25℃,相对湿度50%,噪音低于80分贝,保持动物室环境及鼠笼清洁、透气。本研究经海口市妇幼保健院动物伦理委员会批准(IACUC-2019031903)。实验符合3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

胰岛素(美国 MP Biomedicals 公司,批号0215504401);AP(纯度98%,北京凯瑞基生物科技有限公司,批号CY12140,规格20 mg);链脲佐菌素(STZ)注射液(美国Sigma 公司,批号S0130,每瓶规格1 g);HE 染色试剂盒(碧云天生物技术研究所,批号E677218-0200);TUNEL 试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司,批号10462);空腹血糖(FBG)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海邦景实业有限公司,批号BL3802);空腹胰岛素ELISA 试剂盒(武汉益普生物科技有限公司,批号MM0690R1);葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein78,GRP78) 抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)抗体(美国Abcam 公司,批号ab21685、ab8118);CHOP 抗体、β-actin 抗体、HRP 羊抗兔二抗(上海冠导生物工程有限公司,批号 GDA077207、GD-A05223、GD-L0479);BCA 蛋白定量试剂盒、胰蛋白酶(美国Pierce 公司,批号分别为P0768、P0231)。RM2125RTS 型手动轮转式切片机(德国Leica 公司);SMZ745 型光学显微镜(日本尼康公司);1659001 型蛋白电泳仪、Trans-Blot SD 型半干转膜仪(美国Bio-Rad 公司);GIS-500 型凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司)等。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠GDM 模型建立及分组给药

参照文献[9]构建大鼠GDM 模型,具体操作方法为:取SD 雌雄大鼠,禁食禁水12 h 后测尾静脉FBG 值,挑选出FBG≤6.1 mmoL/L 的雌性大鼠80只、雄性大鼠40 只,并按雌:雄=2 ∶1比例合笼过夜,第2 天早晨对雌性大鼠行阴道涂片检查,挑选70 只受孕大鼠(镜检有精子),并随机取10 只大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液后,用正常饲料喂养作为正常妊娠组(Normal 组);将剩余60 只受孕大鼠腹腔注射45 mg/mL STZ 溶液后,用高脂高糖饲料喂养,复制GDM 模型,建模后第3 天,每只大鼠测FBG 值,若FBG≥16.7 mmoL/L 则造模成功,共造模成功50 只大鼠,随机分为模型组(GDM 组)、AP 低(0.23 g/kg)、中(0.46 g/kg)、高(0.92 g/kg)剂量组、阳性组(胰岛素20 U/kg),每组10 只。各组大鼠于妊娠第5 天开始给药,AP 用生理盐水配制成浓度为低(0.85 mol/L)、中(1.70 mol/L)、高(3.40 mol/L)的混悬液,AP[8]各处理组按10 mL/kg 的剂量灌胃给药,阳性组[9]经皮下注射相应剂量胰岛素,Control组与GDM 组灌胃给予等剂量生理盐水,每天1 次,各组连续给药2 周。

1.3.2 血液标本采集及检测

各组大鼠末次给药禁食禁水12 h 后,取尾静脉血3 mL,以3000 r/min、10 min 的条件离心后,取上清液,按FBG 和空腹胰岛素ELISA 试剂盒说明书检测FBG、空腹胰岛素含量,并根据公式胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FBG × FINS/22.5,计算HOMA-IR。

1.3.3 胰腺组织标本采集及组织病理学染色

各组大鼠在采取完静脉血后,麻醉处死大鼠,快速摘取胰腺组织,剪取0.5 g 组织,于-80℃冰箱保存备用,剩余部分迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h 后,进行常规透明、浸蜡、包埋、切片(厚度为5 μm)后。分别按HE 染色试剂盒及TUNEL 试剂盒说明书进行染色后,置于光镜下观察胰腺组织形态变化并随机选取5 个视野,计算胰岛细胞凋亡率(胰岛细胞凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%)。

1.3.4 Western blot 法检测胰腺组织GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白相对表达水平

取1.3.3 中-80℃保存的胰腺组织,于4℃冰箱中解冻后,匀浆离心分离,取上清液,按蛋白提取试剂盒及BCA 试剂盒提取、检测蛋白总浓度后,取50 μg 蛋白上样,进行电泳、转膜反应及TBST 清洗后,加入5%脱脂牛奶室温封闭2 h,TBST 再次清洗后,加入一抗(GRP78、caspase-12、CHOP、β-actin 抗体,稀释倍数分别为1 ∶1000,1 ∶1000,1 ∶1000,1 ∶2000)后,4℃室温孵育过夜、TBST 振洗后加入HRP 羊抗兔二抗(稀释倍数1 ∶2000),经37℃室温孵育1 h、TBST 清洗后,采用增强化学发光法显色,以凝胶成像仪观察条带并拍照,并以Image-J 软件分析各组蛋白相对表达。

1.4 统计学方法

以SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计分析,计量资料以平均数±标准差()表示,多组间比较进行单因素方差分析,进一步两组间比较行SNKq检验,P<0.05,表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AP 对各组大鼠FBG 含量及HOMA-IR 的影响

与Normal 组相比,GDM 组大鼠FBG 含量、HOMA-IR 均升高(P<0.05);与GDM 组相比,AP低、中、高剂量组及阳性组FBG 含量、HOMA-IR 均降低(P<0.05),且AP 各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低;与AP 高剂量组相比,阳性组上述指标无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2 AP 对各组大鼠胰腺组织病理损伤的影响

Normal 组大鼠胰岛细胞排列整齐,胰腺组织未见明显损伤。与Normal 组相比,GDM 组大鼠可见胰岛细胞萎缩、减少、空泡变性、排列紊乱及炎性细胞浸润等病理损伤严重。与GDM 组相比,AP 低、中、高剂量组及阳性组大鼠胰岛细胞萎缩、减少、变性及炎性细胞浸润等病理损伤现象均有不同程度的改善。见图1。

2.3 AP 对各组大鼠胰岛细胞凋亡的影响

与Normal 组相比,GDM 组大鼠胰岛细胞凋亡率升高(P<0.05);与GDM 组相比,AP 低、中、高剂量组及阳性组大鼠胰岛细胞凋亡率降低(P<0.05),且AP 各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低;与AP高剂量组相比,阳性组上述指标无明显差异(P>0.05)。见图2、图3。

2.4 AP 对各组大鼠胰腺组织GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白表达的影响

与Normal 组相比,GDM 组大鼠胰腺组织GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白表达升高(P<0.05);与GDM 组相比,AP 低、中、高剂量组及阳性组大鼠GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白表达降低(P<0.05),且AP 各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低;与AP高剂量组相比,阳性组上述指标无明显差异(P>0.05),见图4、图5。

表1 各组大鼠FBG 值及HOMA-IR 比较(,n=10)Table 1 Comparison of FBG content and HOMA-IR in each group

表1 各组大鼠FBG 值及HOMA-IR 比较(,n=10)Table 1 Comparison of FBG content and HOMA-IR in each group

注:与Normal 组相比,aP<0.05;与GDM 组相比,bP<0.05;与AP 低剂量组相比,cP<0.05;与AP 中剂量组相比,dP<0.05。Note.Compared with Normal group,aP <0.05.Compared with GDM group,bP<0.05.Compared with the low dose AP group,cP<0.05.Compared with the mid dose group of AP,dP<0.05.

图2 各组大鼠胰岛细胞凋亡率比较Note.Compared with Normal group,aP<0.05.Compared with GDM group,bP<0.05.Compared with the low dose AP group,cP<0.05.Compared with the middle dose AP group,dP<0.05.Figure 2 Comparison of apoptosis rate of islet cells in each group

图3 各组大鼠胰腺组织TUNEL 染色结果Figure 3 TUNEL staining results of pancreatic tissue of rats in each group

图4 各组大鼠胰腺组织GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白表达免疫印迹图Note.A,Normal group.B,GDM group.C,Low dose AP group.D,Middle dose AP group.E,High dose AP group.F,Positive group.Figure 4 Western blot of GRP78,caspase-12 and CHOP protein expression in pancreas of rats in each group

3 讨论

图5 各组大鼠胰腺组织GRP78、caspase-12、CHOP 蛋白表达比较(,n=10)Note.Compared with Normal group,aP<0.05.Compared with GDM group,bP<0.05.Compared with the AP low dose group,cP<0.05.Compared with the AP medium dose group,dP<0.05.Figure 5 Comparison of GRP78,caspase-12 and CHOP protein expression in pancreas of rats in each group

GDM 属于妊娠期间发生的糖尿病,其患病率、确诊率呈逐年升高的趋势,对孕妇及胎儿的危害极大,越来越受到临床研究的重视[10-11]。AP 是从蔬菜和水果中提取的一种安全、低毒的黄酮类化合物,近年来研究发现,其对糖尿病具有较好的治疗作用。刘俊法[12]发现AP 可降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平,缓解多种糖尿病并发症引起其的损伤;候丹等[13]发现AP 可抑制2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠体重增加,并改善2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠糖、脂代谢紊乱及胰岛素抵抗等症状。故本研究推测AP 也可能降低GDM 患者血糖升高及胰岛素抵抗引起的胰腺组织损伤,并建立GDM 大鼠模型对此进行验证,结果发现与Normal组相比,GDM 组大鼠FBG 含量及HOMA-IR 均升高,胰腺组织可见胰岛细胞排列紊乱、萎缩及炎性浸润等病理损伤,胰岛细胞凋亡率增加,提示GDM大鼠出现血糖升高、胰岛素抵抗、胰岛细胞凋亡及胰腺组织损伤等症状,表明造模成功。而与GDM组相比,AP 低、中、高剂量组及阳性组大鼠胰岛组织病理症状减轻,FBG 含量、HOMA-IR、胰岛细胞凋亡率显著下降,且AP 各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低,表明AP 可降低GDM 大鼠血糖及胰岛素抵抗,抑制胰岛细胞凋亡,减轻胰腺组织损伤,对GDM 有一定的治疗作用。

胰岛细胞凋亡、胰岛功能缺陷和胰腺组织损伤是GDM 的主要病理过程[14-15],Pepin 等[16]发现胰岛细胞凋亡和胰腺功能受损是GDM 发生率较高的主要原因。研究发现,ERS 会引起胰岛细胞凋亡和胰腺组织损伤[17-18],郎丽翔等[19]亦发现ERS 参与GDM 过程,GDM 大鼠胰腺组织GRP78、caspase-12蛋白表达升高,ERS 及胰岛细胞凋亡、胰腺组织损伤均加重。魏倩等[8]发现AP 可通过抑制GRP78/CHOP/caspase-12 信号通路表达,缓解丙烯腈所致的大鼠肝组织ERS 和损伤;Feng 等[20]发现AP 可降低心肌组织中CHOP 蛋白表达,降低心肌缺血灌注再损伤大鼠ERS 介导的细胞凋亡和炎性损伤。以上研究提示,AP 可抑制机体内质网应激及组织细胞凋亡和损伤,本研究推测AP 也可能通过抑制胰腺组织ERS 相关信号通路,实现抑制GDM 大鼠胰岛细胞凋亡及胰腺组织损伤的目的。故本研究对GDM 模型大鼠胰腺组织ERS 相关通路蛋白GRP78/CHOP/caspase-12 进行检测,发现,与Normal 组相比,GDM 组大鼠胰腺组织GRP78、CHOP、caspase-12 蛋白表达均增高,表明GDM 组大鼠胰腺组织中GRP78/CHOP/caspase-12 通路处于激活状态,提示胰腺组织ERS 参与GDM 的发生发展。而与GDM 组比较,AP 低、中、高剂量组及阳性组大鼠胰腺组织GRP78、CHOP、caspase-12 蛋白表达均降低,且AP 各剂量组上述指标呈剂量依赖性降低,表明AP 可抑制GDM 大鼠胰腺组织CHOP 通路相关蛋白表达,降低ERS,推测这可能为AP 抑制GDM 大鼠胰岛细胞凋亡及胰腺组织损伤的作用机制。

综上所述,AP 可能通过抑制胰腺组织CHOP通路相关蛋白表达,降低胰腺组织ERS,进而缓解GDM 大鼠胰腺组织损伤和胰岛细胞凋亡,为临床治疗GDM 提供一定参考。GDM 病理过程极其复杂,本研究未设置通路抑制剂进行验证,AP 还可能通过其他途径缓解GDM 胰腺组织ERS 及胰岛细胞凋亡、损伤等病理症状,这有待后续继续深入研究。