城市化对土壤微生物多样性的影响

仇午丹，方 倩

（浙江人欣检测研究院股份有限公司，浙江 宁波 315000）

1.引言

土壤是农业可持续发展的物质基础，土壤微生物是土壤的重要组成部分，其在土壤养分转化循环、统稳定性和抗干扰能力以及土壤可持续发展中占据主导地位[1]。土壤微生物是土壤生态系统变化的敏感指标之一，其活性和群落结构的变化能敏感地反映出土壤生态系统的质量和健康状况[2]。随着城市化的发展，城市中土壤微生物的多样性受到影响，以道路为例来说，大量的汽车尾气排放，会对该土壤中的微生物群落造成一定的影响。长期以来纯培养技术是人们对环境中的微生物进行调查研究和开发的主要方法。本研究在对土壤微生物进行纯培养的基础上，结合形态学鉴定和分子鉴定的手段来研究不同城市化程度的区域中土壤微生物多样性的变化。

2.实验方法与材料

2.1 土样采集

选取嘉兴市中山路为主轴从西至东分别在市区、城乡交界处、乡村土地共五处五点取样法采取土样。采样前除去地面植被和枯枝落叶，铲除表土，挖好深度为10-15厘米的剖面后，先取下层土样，再取上层土样于无菌袋中，贴上标签用橡皮筋宽松扎口，带回实验室4℃冷藏。

2.2 细菌、放线菌分子鉴定

细菌、放线菌分子鉴定采用PCR-RFLP技术此技术克服了微生物培养技术的限制，能在遗传本质的层面上对微生物群落进行较客观的分析，较精确地揭示了微生物的种类和遗传多样性[3]。土样DNA的提取及PCR扩增：用DNA母液pH 8.0(100mmol/L Tris， 100 mmol/L EDTA， 100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L NaCl， 1%CTAB)提取土样DNA后进行凝胶电泳验证。将DNA运用16sRNA作为通用引物进行扩增。和T载体连接：将PCR扩增产物和T-载体在T4ligase的作用下，22℃连接2h或16℃连接过夜。筛选阳性克隆：将连接后的产物，涂布与相应的抗性平板，并平板中添加IPTG和x-gal进行蓝白斑筛选，挑选白色克隆，分别进行PCR验证。酶切：将PCR验证正确的PCR产物，采用限制性内切酶HinfⅠ，HaeⅢ酶切PCR产物；酶切产物电泳检测最后综合各个阳性克隆双酶切图谱类型，来判断土壤中不同类型的细菌。

2.3 微生物数量测定

微生物的数量测定采用稀释平板法[4]。称取10g于90ml无菌水中，37℃摇床30分钟。对摇床后的土壤样液进行10-3～10-7系列稀释后，取100μL涂布在倒好平板的牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌），高氏一号培养基（培养放线菌）和马丁培养基（培养真菌）上。牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h，高氏一号培养基和马丁培养基平板倒置于28℃恒温培养箱中培养3-5天。对每次培养后的菌落计数。挑选合适的平板计算菌落总数。土样微生物数量计算公式：

每克干土中真菌数量=菌落数×稀释倍数/样土质量

2.4 真菌的鉴定

2.4.1 真菌的分离纯化

将28℃恒温培养箱培养后的真菌在操镜台内用接种针点样至平板中单个培养。

2.4.2 真菌的观察和鉴定。

将分离获得的真菌培养一段时间后，制片显微镜观察，根据菌落形态、菌丝分枝、有无孢子孢子形态和菌核特征等形态特征[6]，结合《真菌鉴定手册》[7]鉴定真菌所属。

2.5 真菌多样性指数计算

运用多样性指数(H)、Pielou均匀度指数(J)和丰富度指数(E)等，研究不同生态环境土壤真菌多样性之间的关系[5]。

Shannon—Wiener多样性指数：H′=-ΣPi*lnPi

Pielou均匀度指数：J = lnNi / lnN

丰富度指数：E = (S - 1) / lnN

式中，Pi = ni /N表明第i个种所占的比例，n为第i种的个体数目，N为所有物种的数目，S为物种数目。

2.6 细菌和放线菌分子鉴定

选用细菌16S rDNA通用引物分别为：5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC—3’和 5’—TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C—3’。

PCR扩增 采 用20µL体 系：10×PCR buffer 2.0、10mM dNTPs 0.5µL、上 下 游引物各 10pmol、25mM MgCl22µL、TaqDNA聚合酶0.5µL、模板DNA 1µL，最后加ddH2O补齐至20µL。反应条件为：95℃10min；94℃1min；40℃45s；72℃1 min30s，30个循环；72℃10min。

16S rDNA扩增产物与pUCm-T载体连接，挑选阳性克隆，再进行PCR验证，将验证时扩增到的16S rRNA，采用Hind Ⅲ和BsuRⅠ进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切谱型分析，样品中含有的优势菌种的种数。

3.结果与分析

3.1 土壤中微生物数量分析

表1结果显示，市区，城乡交界，乡村三处土样真菌和细菌的数量逐渐减小，放线菌的数量及土样微生物的总数却逐渐增加。

表1 土样细菌、真菌和放线菌数量

3.2 土样中微生物组成的变化

结果如图1所示， 5个土样中细菌、放线菌和真菌的组成较为相似，表现出细菌 > 放线菌 > 真菌，但是具体各种微生物占的比例还是表现出明显的不同。其中真菌的比例随着城市化程度降低而表现出明显增加，而放线菌的比例则略有减少。

图1 各菌含量百分比图

3.3细菌、放线菌分子鉴定结果分析

对市区、城乡交界和乡村的土样中的细菌和放线菌DNA进行16sRNA扩增，酶切电泳后可探讨土样中优势菌种的分布，结果，A1（市区）土样经酶切电泳后有3种不同条带，故有3种优势菌；A3（城乡交界）土样有10种不同条带，故有10种优势菌；A4（乡村）土样有12种不同条带，故有12种优势菌，结果表明优势菌数量市区<城乡交界<乡村。可见，土样中细菌、放线菌优势菌的数量与城市化程度成反比。

3.4 真菌多样性分析

3.4.1 真菌种属鉴定

本研究对5个土样中的真菌进行鉴定，研究表明，5个土样中的真菌共有19属，其中A1土样有6属，A2土样有5属，A3土样有7属，A4，A5土样均有8属。5个土样中共有的属有：青霉属。A1特有的属有：刺头束梗霉属、梭孢霉属。A2特有的属有：轮枝霉属。A3特有的属有：单梗头孢霉属。A4特有的属有：头状束梗霉属、稀丝头孢霉属、木霉属。A5特有的属有：暗梗穗孢霉属、束丝菌属。结果表明，乡村土样中的真菌种属最多，城乡交界土样次之，市区土样中的真菌种属最少。

3.4.2 真菌多样性分析

通过对五个土样真菌多样性的分析，结果如表2所示。多样性指数表现为农村>城乡交界>市区，丰富度指数表现出农村>城乡交界>市区。从丰富度指数和多样性指数2项生态指数可以看出，农村土壤真菌的丰富度和多样性明显高于城乡交界处土壤和市区土壤。这主要由于农村道路两旁的土壤受污染较小，土壤中的真菌处于一种自然的生长环境下生长，受人类活动影响小。

表2 真菌多样性指数

4.结语

第一，本研究中，不同城市化程度区域土壤中微生物的组成都表现为细菌>放线菌>真菌，这与土壤理化性质和营养条件有关。但是放线菌的比例从市区到乡村表现出降低趋势，真菌的比例则有明显增加。

第二，本研究着重分析了真菌、细菌放和线菌的多样性，结果表明真菌的丰富度指数及多样性指数都表现为：乡村>城乡交界>市区，细菌、放线菌优势菌数量：乡村>城乡交界>市区，推测城市化进程中人类活动会降低土壤中微生物的多样性。