微滴式数字聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌

母润红,聂丹丹,赵 明,马 丽

(1.北华大学基础医学院,吉林 吉林 132013；2.长春海关技术中心，吉林 长春 130000)

WHO将非洲猪瘟列为动物疫病[1]。我国是养猪大国，建立灵敏、准确的诊断方法尤为重要。金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌污染饲料和水源是导致病原传播的重要因素[1-2]。家禽家畜一旦感染此种致病菌可引起相应的传染病，并在畜禽中广泛传播，发病率和传染性均较强[2]。因此，迫切需要开发一种快速定量检测病原体的技术。而微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)检测技术是全新的技术手段[3-4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

标准菌株15株，购自美国典型培养物保藏中心(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、猪霍乱沙门氏菌、李斯特菌、普通变形杆菌、小肠耶尔森菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、阴沟肠杆菌)和长春海关技术中心保存菌株中心(霍乱弧菌、志贺氏菌)。

2×dd PCR预混液和PCR耗材购自Bio-Rad公司；微滴分析读取仪(美国Bio-Rad)。

1.2 样本制备

针对市场上常见的鸡、鸭、猪、羊等牲畜类饲料等10种产品进行本底实验，每种平行3次。

1.3 增菌培养

采用均质器将样品配制进行拍打制成1∶10的样品溶液。金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌按照GB/T 23743方法进行；阴性菌株增菌。

1.4 DNA的提取

取上述培养的增菌液各1 mL均加到1.5 mL无菌离心管中，按照常规CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取模板DNA。

1.5 PCR扩增

金黄色葡萄球菌的nuc特异性基因序列、蜡样芽孢杆菌的16 s保守基因序列对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌进行鉴定。参考文献，引物的序列见表1。将得到如下的反应体系和扩增参数:模板DNA 5 μL,上、下游引物各4 μL,探针1 μL，2×dd PCR预混液10 μL，总体积20 μL(见表2,其中空白对照实验时用双蒸水替代样品DNA,阴性对照实验时用非目标源性成分替代样品DNA,阳性对照实验时用金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌阳性成分DNA)。

内标扩增参数:模板DNA 5 μL,上、下游引物及探针各1 μL,去离子水2 μL，2×dd PCR预混液10 μL，总体积20 μL(见表2)，退火温度60℃。

表 1 引物探针序列

表 2 双重PCR反应体系

1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)反应条件的建立

总体系20 μL，按引物浓度(0.5～1.0 μmol/L)、探针浓度(0.1～0.5 μmol/L)、退火温度(55～60 ℃)条件优化实验。通过比较Ct域值、荧光信号强度和熔解曲线扩增效率来判定优化结果，并设阴性对照。

1.7 ddPCR反应条件的建立

与qPCR反应相同的引物和探针进行ddPCR 反应，2×Supermix for probes (without dUTP) 12.5 μL，上、下游引物终浓度为10 μmol/L，探针终浓度为10 μmol/L，模板5 μL，ddH2O补足20 μL。总体积20 μL。将反应液加入微滴生成卡一排，70 μL微滴生成油加入最后一排，盖上胶垫，置入微滴生成仪，微滴反应自动生成。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃ 10 min。扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中进行信号读取，并使用软件Quanta soft V1.3.2.0分析实验数据，获得检测结果并分析。

1.8 ddPCR特异性和重复性实验

以DNA浓度1×108～1×103copies/μL的10倍系列梯度稀释为模板进行ddPCR反应，每个梯度浓度设立重复3孔，同样的反应条件重复6次，通过RSD判断该方法的重复性和稳定性。

1.9 ddPCR敏感性实验

取浓度为1×108copies/μL纯菌液10倍浓度依次稀释，进行检测，设置每个梯度浓度重复3次。

1.10 ddPCR本底实验

采用10种常见饲料产品进行本底实验，每种平行3次。

2 结 果

2.1 特异性实验

ddPCR对提取和制备的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌及15株其他病原菌DNA作模板，评价建立ddPCR方法特异性。结果显示，金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌均呈现阳性扩增信号，每孔微滴生成量均衡(图1,蓝色是金葡菌，绿色是蜡样);而15株其他病原菌实验孔均未检出到阳性微滴信号，均不存在交叉反应，表明建立的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌ddPCR方法特异性较强。

2.2 ddPCR扩增的重复性实验

以5个浓度梯度的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌DNA为模板设立重复性实验，每个浓度设置3个重复孔，重复6次，测定组内和组间相对标准差。结果显示，金黄色葡萄菌数据结果平均值为88 copies/μL,SD为6.8,RSD为6.37%(图2a);蜡样芽孢杆菌数据结果平均值为233 copies/μL,SD为19.7,RSD为2.03%(图2b)。表明ddPCR对其扩增稳定，实验数据可信。

图 1 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌特异性检测

图 2 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌ddPCR重复性实验

2.3 ddPCR扩增的灵敏度实验

测定金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌DNA浓度，将系列10倍梯度稀释(108～103copies/μL)，测定ddPCR灵敏度。结果显示，建立的ddPCR方法的最低检测极限大约为1×104拷贝(图3)。表明ddPCR检测方法灵敏度较高。

图 3 金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌双重灵敏性实验

2.4 ddPCR本底实验

本实验采用10种常见饲料产品进行本底实验，每种平行3次，进行本底实验，经实验验证均未检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。

3 讨 论

高营养饲料在消毒不当等情况下，易生长有害菌，可使饲料产生毒素，危害畜牧生产。金黄色葡萄球菌多为致病性病原菌，致病力较强；芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌极易引起食物中毒。目前qPCR法是食源性病原体检测的主要方法，此方法依赖Ct值和制作标准曲线，同时样品中抑制剂都会影响检测的准确性,结果极易出现假阴性[5]。ddPCR检测手段排除了qPCR法的弊端和不足，该方法无需制作标准曲线，痕量水平检测[5-7]。建立双重ddPCR方法对饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的检测是基于qPCR技术基础上发展而来的，而且灵敏度更高[8]。

本研究将qPCR法优化反应系统中引物和探针浓度应用于ddPCR法可以扩增出目标靶点，发现引物浓度过高和过低扩增条带均不能明显区别出来,探针浓度也影响ddPCR法微滴的离散分布，所以最佳的引物浓度和探针浓度配比优化是ddPCR检测结果高效性的主要因素。本实验显示，ddPCR法检测稳定性良好，具有较高的检测灵敏度。将建立的检测方法运用到10种常见饲料产品进行本底实验中，均未检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。建立饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的双重ddPCR检测方法，对于保障养殖业发展、保护我国饲料产品安全和经济利益具有十分重要的意义。