熊果酸28 d经口染毒对ICR小鼠毒性作用

何嘉宇，高 锐，陈振宇，谭振宇，覃 锐，郗艳丽*

(吉林医药学院:a.公共卫生学院；b.临床医学院，吉林 吉林 132013)

熊果酸主要分布于女贞子、夏枯草、车前子、山楂、大枣和苦丁茶等植物中[1-2]。熊果酸能改善动脉粥样硬化大鼠的炎性反应和氧化应激[3]，缓解香烟引起的大鼠肺气肿[4]，治疗糖尿病小鼠的心肌病变[5]，抑制CCl4所致的小鼠肝组织出现损伤[6]。此外，熊果酸还能通过促进糖原合成酶激酶发生磷酸化而引起肝癌细胞HepG2发生凋亡[7]。熊果酸能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱发胃癌细胞MGC-803发生自噬[8]。沙棘中的熊果酸能对H22荷瘤小鼠的移植瘤起到抑制作用[9]。研究还发现，熊果酸能显著抑制人肺癌细胞PC9的增殖，并诱导其发生自噬[10]。表明熊果酸除了治疗作用以外，还具有一定的毒性作用。但关于熊果酸的体内毒性研究较少。本研究以连续28 d染毒的方法观察熊果酸对ICR小鼠的毒性作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

熊果酸(上海麦克林生化科技有限公司)；尿素氮(urea，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、胆固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)(南京建成生物工程研究所)；安稳血糖试条(三诺生物传感股份有限公司)。

Epoch多功能酶标仪(美国BioTek)；NIU科研级正置荧光显微成像系(美国Nikon)；QUINITIX124-1CN电子天平(美国 塞多利斯)；石蜡切片机和组织包埋机(德国Leica)。

ICR小鼠，清洁级，18～22 g，雌雄各半，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号：SCXK(吉)-2018-0007。饲养于吉林医药学院实验动物中心。基础饲料喂养，饲料购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2015-0005。饲养条件：温度18～22℃，湿度45～65 ℃，12 h明暗交替。所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》和《动物毒理学使用原则》进行，并经吉林医药学院医学伦理委员会批准(许可证号：2018LW011)。

1.2 实验分组和给药

ICR小鼠50只，随机分为5组，即空白对照组,溶剂对照组和熊果酸低、中、高剂量组(5、10和15 mg/kg)，每组10只。除空白对照组和溶剂对照组，各组均给予熊果酸混悬溶液(熊果酸溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，现用现配，超声混匀)灌胃，连续28 d，1次/d，空白对照组给予相同体积的生理盐水灌胃，溶剂对照组给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。

1.3 观察指标

一般情况观察:实验期间，每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。

脏/体比:末次给药后禁食不禁水24 h，称量小鼠体重后眼球取血处死，并对所有动物进行大体肉眼观察，处死动物后打开腹腔观察内脏形态，剥离脏器组织并用生理盐水洗净，滤纸蘸干后称重，计算脏/体比值。

血液学指标检测:给予受试物28 d后，小鼠禁食不禁水24 h，眼球取血处死小鼠，留取血液测定血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类。

血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST和血糖的含量测定:留取血液，血糖仪测定血糖。剩余血液，3000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书检测各组血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST的含量。

病理组织学观察:将组织于4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切皮备用，用于HE染色，光学显微镜下观察，并拍照。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS16.0统计软件进行分析，结果用均数±标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法检验，两组间比较用t检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 一般情况观察

各组小鼠的生长发育、活动均正常，未发现中毒现象和死亡情况。

2.2 熊果酸对小鼠体重、增重、进食量和饮水量的影响

结果显示：与对照组比较，受试样品各剂量组小鼠初始体重、雌鼠每周进食量差异无统计学意义(P>0.05)。与第1周比较，雄鼠第2周的进食量显著增高，但第3周升高不显著。随着给药时间的延长，各组雄性小鼠的饮水量逐渐升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与第1周比较，第2周和第3周低剂量雌性小鼠饮水量显著升高，但中和高剂量组雌性小鼠饮水量显著低于低剂量组(P<0.05)。见图1。各组小鼠终末体重显著低于初始体重(P<0.05)，总体重增加量呈现负数，总体动物体重呈现下降的趋势，这可能与灌胃的给药方式有关。通过灌胃造成动物出现饱腹感，食物的摄入量减少，动物体重出现下降。此外，各剂量组的小鼠体重下降也比较明显，熊果酸的给药剂量越多，各剂量组小鼠的体重下降越明显。见表1。

与空白对照组比较，*：P<0.05；与溶剂对照组比较，#：P<0.05；与第1周比较，&：P<0.05

表 1 各组小鼠体重增加量

2.3 熊果酸对小鼠脏/体比值的影响

打开腹腔观察内脏形态未见明显改变，各组小鼠肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺脏脏/体比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量组雌性小鼠心脏绝对重量高于空白对照组、溶剂对照组、低和高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组雄性小鼠心脏绝对重量高于空白对照组、溶剂对照组、低剂量和中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。雌性小鼠中剂量组脾脏绝对重量显著低于溶剂对照组(P<0.05)。雄性小鼠低剂量组脾脏绝对重量显著高于空白对照组和溶剂对照组，中和高剂量组脾脏的绝对重量显著低于低剂量组，低、中和高剂量组肺脏绝对重量显著低于溶剂对照组(P<0.05)。各剂量组小鼠肝脏和肾脏绝对重量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 熊果酸对各组小鼠血液中血常规的影响

溶剂对照组各组小鼠血常规指标与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。熊果酸低、中和高剂量组小鼠血常规指标与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 熊果酸对小鼠血清中BUN、Cr、TG、TC、AST和血糖的影响

结果显示：各剂量组小鼠血清中的BUN、Cr、TG、TC、AST和血糖水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各剂量组雌性小鼠血清中ALT水平显著低于对照组(P<0.05)，且随着给药剂量的增加，ALT的水平逐渐降低。熊果酸中和高剂量组雄性小鼠血清中ALT水平低于对照组和低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表 2 各组小鼠血清中BUN,Cr,TG,TC,ALT,AST和血糖的含量

2.6 病理检查

各剂量组与对照组比较，肝脏、肾脏、脾脏、心脏、胃、十二指肠组织未见有意义的病理改变。

3 讨 论

熊果酸是苦丁茶、酸枣、女贞子等植物中的化学物质，具有较高的生物活性及潜在药用价值。但对熊果酸的毒理学评价资料较少，根据前期熊果酸急性毒性实验和预实验结果，设计本次毒性实验。

对小鼠体重、进食量和饮水量的结果观察显示，各组动物生长发育、活动均正常，未出现中毒和死亡。随着染毒周期的延长，雌性小鼠的饮水量和摄食量变化均不显著；雄性小鼠饮水量变化不显著，但进食量显著升高。各剂量组小鼠终末体重显著低于初始体重，雌性小鼠总体重增加量显著低于空白对照组，雄性小鼠总体重增加量与空白对照组比较差异无统计学意义。这提示小鼠体重下降可能与熊果酸有减肥的作用有关，该作用对雌鼠的作用比较显著，且这种减轻体重作用与剂量呈现依赖关系。

各剂量组小鼠脏/体比值结果显示，各组小鼠脏/体比值差异比较无统计学意义。各剂量组小鼠心脏的绝对重量与空白对照组比较有显著差异，脾脏的绝对重量与溶剂对照组比较差异有显著性，但这种差异变化没有显著的剂量-反应关系，故不认为是损伤效应。熊果酸对受检脏器组织病理方面无明显损害。

熊果酸各剂量组小鼠血清中ALT水平随给药剂量的增加而逐渐降低，且比较差异有统计学意义，AST的水平也随着熊果酸给药剂量的增加而逐渐降低，但比较差异无统计学意义。血清中ALT和AST水平的变化呈剂量-反应关系，这提示熊果酸对肝脏组织有一定的保护作用。适当摄入富含熊果酸的食物有益于改善肝脏功能。血清生化指标中BUN、Cr、TG和TC的变化不显著。各组小鼠血常规指标比较差异不显著，表明熊果酸未诱发炎性反应或凝血障碍。

综上所述，熊果酸具有较好的减肥作用，且有益于肝脏的健康。熊果酸在(5～15)mg/(kg·bw)剂量范围内以经口灌胃的方式摄入，未对ICR小鼠造成明显的毒性效应。此结果能为熊果酸亚慢性毒性提供毒理学基础资料，为熊果酸作为中药制剂的研发提供实验依据。