miRNA-27a 在乳腺癌中的表达及其对新辅助化疗疗效的预测价值

朱文龙，杨海松，张世泳，张萌萌，杨 清

microRNA（miRNA）是一种内源性非编码RNA（non-coding RNA），由19 ～25 个核苷酸构成，为单链RNA，调控基因转录后表达，参与较多生物学过程［1-6］。 miRNA-27a 被证实在多种恶性肿瘤组织中表达，且与化疗耐药具有一定相关性［7-14］。 本研究旨在探究miRNA-27a 在人乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌多药耐药之间的关系， 为miRNA-27a 成为临床上提高乳腺癌患者化疗敏感性的分子标志物提供更多的实验依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017 年6 月～2019 年1 月在贵州医科大学附属医院乳腺外科治疗拟行新辅助化疗的乳腺癌患者100 例为实验组，行手术治疗的乳腺纤维腺瘤患者40 例为对照组。 收集两组研究对象的病灶组织，统计患者的发病年龄、月经状态、雌激素受体（ER）、孕激素受体、人表皮生长因子受体2（HER-2）等临床病理特点。

乳腺癌患者入组标准：（1）女性，具有新辅助化疗指征；（2）化疗前经影像学、核医学检查无远处转移者，无同期发生的其他器官的恶性疾病；（3）入院前未接受任何相关治疗，排除内分泌治疗、化疗及放疗对研究对象肿瘤大小、临床分期、淋巴结状态等的影响；（4）有可测量或可评价的肿瘤病灶、钼钯或B 超可测病变直径≥2 cm；（5）化疗前均在超声引导下行穿刺活检证实为乳腺癌，且病理类型均为浸润性导管癌；（6） 化疗前穿刺活检标本行ER、孕激素受体、HER-2、Ki-67 免疫组织化学检查；（7）无明显化疗禁忌。 排除标准：（1）有远处转移的Ⅳ期患者；（2）有化疗禁忌，不能耐受化疗的患者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案 化疗方案统一采用以蒽环类为基础的每两周EC 方案（表柔比星100 mg/m2，第1天；环磷酰胺600 mg/m2，第1 天），序贯紫杉类每周P 方案（80 mg/m2）化疗。 完成新辅助治疗后12 ～21 d 接受手术治疗，所有患者治疗前均签署相关治疗知情同意书。

1.2.2 疗效评价 根据实体瘤反应评价标准（the response evaluation criteria in solid tumors，RECIST，1.1 版），完全缓解（CR）和部分缓解（PR）为有效，疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）为耐药。对手术标本应用病理组织学评价新辅助化疗疗效，病理性完全缓解（pCR）以手术标本连续切片原发肿瘤区域无浸润癌组织、区域淋巴结无癌残留为标准。

1.3 测定mi-R27a 的表达 用Trizol RNA 试剂盒提取乳腺癌及乳腺纤维腺瘤手术标本中总RNA，操作按照说明书进行，测量总RNA 浓度，取1 μg RNA 按反转录合成试剂盒说明合成cDNA，使用实时荧光定量PCR 仪检测miR-27a 的表达情况。GAPDH 为内参，正向引物为：CGGAGTCAACGGAT TTGGTCGTAT，反向引物为：AGCCTTCTCCATGGT GGTGAAGAC；miR-27a 正向引物为：TAATCGTGT TCACAGTGGCTAAG；反向引物为：AAAGGTTGAT CTCGTCTCTCA。 反应条件：95 ℃3min，（95 ℃12s，62 ℃60 s）× 40 cycles。 反应结后确认Real-time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行PCR 定量时制作标准曲线。 基因的表达量F=2-△△Ct，3 次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-△△Ct的方法进行分析。

1.3.1 主要试剂 Trizol 试剂购自美国Invitrogen有限公司； 组织裂解液、miRNA 反转录试剂盒、qPCR 试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿购自天津科密欧化学试剂有限公司；内参GAPDH 引物，miR-27a 引物购自昆明鼎国生物。

1.3.2 主要仪器 双人单面超净工作台，微量可调加样器，台式冷冻离心机，涡旋混匀器，TG-16W 台式高速离心机，电泳仪、电泳槽、转移槽，紫外分光光度仪NanoDrop1000，Real-Time 实时荧光定量PCR。

1.4 统计学处理 应用SPSS 21.0 软件进行数据分析，采用医学统计绘图软件GraphPad Prism 7 绘制统计图。分析结果用（x±s）表示，比较方法采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效 新辅助化疗后，达到完全缓解患者共17 例，部分缓解患者共61 例，疾病稳定患者共22 例，疾病进展患者共0 例，其中达到pCR 患者共26 例。 评估为化疗有效患者共78 例， 有效率为78%，pCR 率为26%。

2.2 miR-27a 在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤中的表达Real-time PCR 方法检测乳腺癌组和乳腺纤维腺瘤组中miR-27a 的表达，结果显示miR-27a 在乳腺纤维腺瘤组中高表达，与乳腺癌组相比，表达增高（2.1 ± 0.30）倍，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。再进一步分析乳腺癌亚组，结果显示miR-27a 在化疗有效组中高表达，与无效组相比，表达增高（2.8 ±0.30）倍，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图1 乳腺纤维腺瘤组和乳腺癌组miR-27a 相对表达量

2.3 miR-27a 在乳腺癌患者中的表达及其与临床病理特征的关系 分析miR-27a 的表达与患者临床病理特征的关系，发现miR-27a 低表达患者的雌激素受体和孕激素受体阳性率高于miR-27a 高表达患者（P＜0.05）。 相较于miR-27a 的低表达的乳腺癌患者，高表达miR-27a 的患者有较高的pCR 率（P＜0.05）。 相较于miR-27a 的低表达的乳腺癌患者， 高表达miR-27a 的患者有着更好的化疗疗效（P＜0.05）。 而与其他临床病理特征无明显相关性（P＞0.05），见表1。

图2 乳腺癌化疗有效组和乳腺癌化疗无效组miR-27a相对表达量

表1 miR-27a 在乳腺癌患者中的表达及其与临床病理特征的关系

3 讨论

研究证实，miRNA-27a 参与乳腺癌的发生、发展过程［15-16］。 miRNA-27 存在于19 号染色体上，miRNA-27a 能够负向调控基因的表达， 通过与靶3'UTR 区（3-untranslated region）特异性结合发挥作用［17］。研究表明，miRNA-27a 可促进肿瘤发展、诱导原始粒细胞分化等过程， 已被证实高表达于乳腺癌、宫颈癌及胃癌等癌组织中，与化疗、放疗及内分泌耐药等密切相关［18-19］。

既往有少量研究表明，miRNA-27a 高表达于乳腺癌组织中，miRNA-27a 表达越高的患者临床分期越晚，而在晚期乳腺癌中miRNA-27a 表达则更高［20-21］。 提示miRNA-27a 为促癌miRNA。 然而，本研究发现，miRNA-27a 在乳腺纤维腺瘤中的表达明显高于乳腺癌组织中的表达。这提示miRNA-27a可能在乳腺癌中起到抑癌作用。 可见miRNA-27a在乳腺癌组织中的表达情况尚无统一结论，需更多的研究来探索明确。

有研究者发现在肝癌细胞中，miRNA-27a 可通过抑制FZD7/β-catenin 通路来下调MDR1/P-gp 的表达， 从而逆转肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药［22］。也有研究发现miR-27a 通过降低MDR1/P-gp 的表达，从而逆转白血病细胞株对化疗的耐药性，该细胞株存在多柔比星的耐药性［23］。 miR-27a 通过降低MDR1/P-gp 的表达能够提高胃癌细胞对阿霉素的敏感性［24］。 相似的结论在卵巢癌的研究中证实，miR-27a 调控MDR1/P-gp 的表达，逆转卵巢癌细胞对化疗药物的耐药性［25］。 本研究分析miRNA-27a的表达与患者临床病理特征的关系后发现，高表达miRNA-27a 的患者，新辅助化疗后有较高的pCR 率；且与乳腺癌耐药组相比，化疗有效组中的miRNA-27a 的表达明显升高。 这可能与miRNA-27a 在乳腺癌中的高表达可能逆转肿瘤对药物耐药有关。

乳腺癌是一种高度异质性疾病， 研究相较于其它非三阴性乳腺癌，三阴性乳腺癌中miRNA-27a的表达较高［26-27］。 本研究发现雌激素受体、孕激素受体阴性的患者中miR-27a 的表达高于雌激素受体、孕激素受体阳性的患者，表明miRNA-27a 可能与乳腺癌的分子分型密切相关，并且可能参与调控内分泌治疗疗效。

本研究提示乳腺癌中miRNA-27a 高表达者有较高的pCR 率，其表达能够作为预测乳腺癌新辅助化疗疗效的指标。 miR-27a 低表达患者的雌激素受体、 孕激素受体阳性率高于miR-27a 高表达患者，其表达可能与内分泌治疗疗效相关。 本研究样本量较小， 后续会进一步扩大样本量进一步验证miRNA-27a 在乳腺癌组织中的表达情况，并进行密切随访分析miRNA-27a 与预后的相关性。 而miRNA-27a 的下游靶基因及其相关的分子机制，还需体内体外实验深入研究其相关分子机制，miRNA-27a 可能成为乳腺癌的诊断、治疗及预后判断的新靶点。