绿豆发芽过程中多酚组成及抗氧化活性的变化

魏美霞 梁雪梅 林欣梅 曹龙奎 李志江,3,4 鹿保鑫,4

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319) (黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室3，大庆 163319) (黑龙江省杂粮加工及质量安全工程技术研究中心4，大庆 163319)

绿豆，又名青小豆、植豆等，是我国传统农作物之一。近些年来，由于人们饮食观念的改变和对营养健康生活的追求，绿豆及其芽苗产物因其具备丰富的营养价值得到了更加广泛的关注[1]。绿豆在含有大量营养物质和生物活性物质[2-4]的同时也存在一些抗营养化合物，如植酸、单宁、蛋白酶抑制剂等，这些抗营养化合物的存在限制了绿豆中碳水化合物、蛋白质、微量元素等在机体的生物利用度[5]。有大量研究表明绿豆在进行发芽处理后，绿豆中抗营养成分的含量明显减少，并且与未发芽绿豆相比其营养价值水平又有显著的提高[6]，尤其是酚类[7]和膳食纤维类[8]化合物。López等[9]通过研究发芽对豆类酚类物质的影响，结果发现发芽后酚类化合物含量及抗氧化能力均有提高。Cevallos等[8]分析研究绿豆、蚕豆等13种可食种子在萌芽过程中酚类物质含量及活性的变化，结果发现发芽后各个种子活性物质及抗氧化活性有不同程度的增加。

绿豆芽与人们的日常饮食密切相关，确定绿豆芽发芽时期以获取高活性多酚化合物在日常生活和工业生产中都十分重要，但是目前对绿豆芽多酚化合物的研究还比较笼统和模糊，绿豆在发芽过程中多酚活性物质是如何变化的尚不清楚。因此本实验以未发芽绿豆、绿豆芽长0～1、1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 cm及6 cm以上的8个时期绿豆芽为原料，考察绿豆在发芽过程中多酚化合物组成及抗氧化活性的变化，从而确定富含活性多酚化合物的绿豆发芽时期，为以后绿豆芽在多酚活性物质上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

绿豆：颗粒饱满均匀，色泽深绿，无破损的山西大同小明绿豆。

福林酚试剂、没食子酸、DPPH(标准品)、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、AB-8型大孔树脂；甲醇、乙腈、醋酸铵、甲酸为LC-MS级；无水乙醇、Na2CO3、FeSO4、水杨酸等均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

YB-1000A型高速多功能粉碎机，CW-2000型超声-微波协同萃取仪，TDZ5-WS型低速自动平衡离心机，RE-2000A型旋转蒸发仪，SHB-(Ⅲ)A多功能循环水式真空泵，真空冷冻干燥机，Beta2-8LD plus真空冷冻干燥机，TU-1810型紫外可见分光光度计，MD200-2氮吹仪，Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色谱，Q-Exactive HF高分辨质谱，Zorbax Eclipse Sepax HP-C18 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理

绿豆经除杂漂洗3～4遍后平铺于绿豆芽机中进行发芽处理，设置温度为25 ℃，每隔2～3 h自动淋水，分别量取未发芽绿豆与发芽芽长为0～1、1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 cm及6 cm以上时的绿豆芽于45 ℃鼓风干燥箱中烘干，经高速粉碎机粉碎后过80目筛制成绿豆芽粉，真空包装后于0～4 ℃冰箱存储备用。

1.2.2 绿豆芽多酚的提取

根据Zhang等[10]方法稍作修改，准确称取2.0 g绿豆芽粉于烧杯中，以1∶30的料液比加入60 mL 60%的乙醇溶液，混匀后置于超声-微波萃取仪中，设置超声时间1 000 s、超声温度35 ℃、超声功率400 W，萃取结束后取出置于离心机中，在转速为4 000 r/min下离心10 min，收集上清溶液。向沉淀物中再次加入60 mL 70%乙醇水溶液，重复上述步骤，合并两上清液于旋转蒸发仪中，在45 ℃条件下旋至无水状态，残余物用70%甲醇洗出定容至10 mL，得待测绿豆芽多酚提取液，分装后冻存于-20 ℃的冰箱中备用(实验前利用氮吹仪除去甲醇)。

1.2.3 绿豆芽多酚含量的测定

根据Folin-Ciocalteu法稍作修改[11]，得线性方程为y=0.117 7x+0.004 8，R2=0.999 8，线性关系良好。多酚含量测定结果以干基1 g绿豆芽粉样品中所含没食子酸当量(mg gallic acid equivalents/g dry weight)表示，简写为mg GAE/g DW。

1.2.4 绿豆芽发芽过程中多酚抗氧化活性的检测

1.2.4.1 DPPH清除能力的测定

根据Nevcihan等[12]方法稍作修改，以无水乙醇作为对照，平行3次实验。

式中：A0为空白组的吸光度值；A1为样液测定组的吸光度值；A2为乙醇对照组的吸光度值。

1.2.4.2 总抗氧化能力(T-AOC)的测定

利用南京建成总抗氧化(T-AOC)试剂盒测定，根据其说明书平行3次实验，于520 nm处测定吸光值。

式中：OD测量为待测样品吸光值；OD对照为对照样品吸光值；V反为反应液重量；V取为取样量。

1.2.4.3 羟自由基清除能力的测定

根据水杨酸法结合实际稍作修改[13]，配制9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，9 mmol/L FeSO4溶液，8.8 mmol/L H2O2溶液，按1 mL FeSO4，1 mL水杨酸-乙醇，0.3 mL样液，0.7 mL水，1 mL H2O2的顺序依次加入试管中，37 ℃水浴锅中温浴30 min，用水做空白对照，510 nm处测定吸光值，平行3次实验。

式中：Ak为空白组的吸光度值；Am为样液组的吸光度值；An为对照组的吸光度值。

1.2.5 绿豆芽多酚的分离纯化

根据高云涛等[14]的方法稍作修改，选择AB-8大孔树脂对绿豆芽多酚提取液进行分离纯化。大孔树脂经无水乙醇浸泡24 h后，去离子水洗去乙醇至中性，浸泡在去离子水中备用。采用径高比1∶13、PH为6、上样质量浓1.8 mg/mL、流速3.0 BV/h的纯化条件进行动态吸附。大孔树脂吸附饱和平衡后，先用去离子水洗去柱内杂质，再用70%乙醇溶液以2.0 BV/h的流速进行动态洗脱，收集纯化后的绿豆芽多酚于45 ℃旋转蒸发仪中进行浓缩处理。将纯化后的绿豆芽多酚浓缩液在-24 ℃冰箱中预冻18 h后置于真空冷冻干燥机中，真空度0.1 kPa以下，冷阱温度-55 ℃下干燥12 h，得到纯化后绿豆芽多酚冻干粉末存储于干燥器中备用。

1.2.6 绿豆芽发芽过程中多酚组成的鉴定分析

通过超高效液质联用(HPLC-MS/MS)技术分离鉴定纯化后绿豆芽多酚中的小分子化合物，结合质谱数据库信息注释和分类，使用Compound Discoverer 3.0对其组分进行定性分析[15-17]。

绿豆芽多酚样液的制备：不同芽长绿豆芽多酚冻干粉，加入甲醇复溶，0.45 μm 微孔滤膜过滤，制成高效液相色谱-质谱联用检测的待测液。

超高效液质分析条件：色谱柱：Zorbax Eclipse C18色谱柱 (1.8 μm·2.1·100 mm)，液相色谱条件：流动相A为0.1%甲酸，流动相B为100%乙腈，线性梯度洗脱条件为0～5 min，98 A/2B；5～20 min，2 A/98A；20～25 min，98 A/2B；25～30 min，98 A/2B。柱温30 ℃，进样量2 μL，流速300 μL/min。质谱条件：加热器温度300 ℃；鞘气流速45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.0 kV；毛细管温度：350 ℃；S-Lens RF Level, 30%。碰撞模式为高能量碰撞解离(HCD)。

1.2.7 数据分析

采用 SPSS 17.0、Excel 2013进行数据的统计分析和处理，显著性分析采用 ANOVA 单因素方差分析，相关性分析采用Pearson 法线性回归处理。实验数据均为 3 次平行测定，结果以平均值±标准偏差(SD)表示，P<0.05时表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 芽长对绿豆芽多酚含量的影响

由图1可知，各发芽时期绿豆芽多酚含量差异性显著。绿豆在0～3 cm萌芽时期，其多酚含量较未发芽绿豆减少了7%～12%。在绿豆芽芽长为4～5 cm时，其多酚含量达到最高，较未发芽绿豆提高了38%。然而，随着芽长的不断生长，绿豆芽多酚的含量开始减少。这可能与绿豆芽及根中的多酚氧化酶的活性有关，绿豆在萌芽阶段，活性较高的多酚氧化酶氧化一部分多酚化合物，因此，多酚含量较低，而随着芽长的增长，多酚氧化酶活性降低，绿豆芽多酚含量开始升高[18]。而当芽长增至6 cm及6 cm以上时，绿豆芽的多酚含量虽有所增加，但仍低于芽长为4～5 cm的绿豆，该结果与Huang等[19]得到的发芽初期芽长增长显著，且在1～2 d(3～5 cm)时总酚含量增加明显的结果相似，并且在发芽2 d(5 cm)时抗坏血酸含量最高。

注：不同小写字母表示差异性显著(P<0.05),余同。图1 绿豆芽长对多酚含量的影响

2.2 发芽对绿豆多酚抗氧化活性的影响

由图2可知，绿豆在发芽过程中多酚化合物对DPPH、羟自由基的清除能力和总抗氧化能力的变化趋势整体相似。相比未发芽绿豆，在绿豆芽长0～1 cm 时多酚的抗氧化能力均显著升高。结合图1、表1、表2推测可能是由于芹菜素的出现，木犀草甘、野漆树苷等黄酮化合物含量的增加；在芽长4～5 cm时，DPPH、羟自由基清除率及总抗氧化能力均达到最大值，绿豆芽多酚的DPPH清除率为93.82%，相比于未发芽绿豆提高了8.8%；羟自由基的清除率为93.90%，相比于未发芽绿豆提高了17.4%；总抗氧化能力为8.32 U/mg，相比于未发芽绿豆提高了34%。该结果可能是由于在此期间多酚的种类和含量均达到最大，多酚总浓度达到最高，是整个发芽过程中多酚化合物种类最丰富的时期，这结果分别与付晓燕等[20]在研究燕麦发芽过程中DPPH的清除能力结果，吕俊丽等[21]在研究莜麦发芽过程中羟自由基的变化结果及徐建国[22]研究燕麦发芽过程中多酚含量及其抗氧化活性的变化相近。

图2 发芽对绿豆多酚抗氧化活性的影响

2.3 芽长对绿豆芽多酚组分的影响

本实验共定性出 39种多酚化合物，包含28种黄酮类化合物，11种异黄酮类化合物，这与董银卯等[23]叙述的萌芽绿豆中多酚组成结果相似。由表1、表2可知，绿豆在发芽后产生了4种新的异黄酮类化合物：豆苷、金雀异黄酮、补骨脂甲素和染料木苷，7种黄酮类化合物：芹菜素、白杨素、姜黄素、樱花素、异懈皮苷、橙皮苷、夏佛塔苷。原有的多酚化合物随着发芽周期的不同，其相对质量分数也发生了变化，不同芽长绿豆芽间多酚组成存在明显差异，各发芽时期多酚化合物相对含量差异性显著。

表1 不同绿豆芽长异黄酮的分布情况

表2 不同绿豆芽长黄酮类化合物的分布情况

绿豆发芽前后多酚化合物主要以牡荆素、大豆苷元、香豆雌酚、芹菜素等为主。除6 cm以上绿豆芽，其余时期的牡荆素的相对质量分数随着芽长的增长整体呈现下降趋势，这与董银卯等[23]对绿豆芽发芽过程中牡荆素含量变化的研究结果相似；大豆苷元是大豆异黄酮最主要的组成之一，对心血管疾病、肿瘤、癌症、骨质疏松症、更年期综合征、衰老等有极好的预防效果[24，25]，在发芽过程中其相对质量分数随着芽长的增长而显著增加，这与周光明等[26]对绿豆芽发芽过程中大豆苷元的变化情况基本一致；香豆雌酚[27]属于植物雌激素，具有雌激素活性。已有大量研究[28，29]表明其对结肠癌、子宫肌瘤、乳腺癌等具有很好的抑制作用，并且能够预防女性绝经后的骨质疏松、生殖系统紊乱等疾病；绿豆在发芽后，芹菜素的相对质量分数表现出先上升后下降的趋势，分析可能是在萌芽过程中，绿豆为了合成次级代谢产物，需要通过糖苷中的小分子化合物提高能量，绿豆种子在吸收水分时，由于内源性葡萄糖苷酶的存在，其原有的黄酮类化合物被水解成芹菜素后又被转化为其他黄酮类化合物[30]。与董银卯等[23]研究结果相似。芽长4～5 cm时多酚化合物达到33种，包含22种黄酮类化合物、11种异黄酮类化合物，是整个发芽过程中多酚化合物种类最丰富的时期，大豆苷元、香豆雌酚相对质量分数较高。

2.4 相关性分析

分析绿豆多酚抗氧化活性与绿豆芽长、多酚含量及组成的关系。由表3可知，绿豆芽多酚含量的变化与芽长呈现出显著正相关(P<0.05)，绿豆芽多酚对羟自由基的清除能力与对DPPH的清除能力呈现出极显著正相关(P<0.01)。但是通过相关性分析发现，绿豆芽多酚的抗氧化能力与多酚含量的关系并不显著，分析可能是由于绿豆在芽长4～5 cm时异黄酮类物质含量和种类增加，从而使DPPH、羟自由基清除能力及总抗氧化能力增强。这与孙海燕[31]在对干红葡萄酒多酚组分与抗氧化活性之间相关性分析结果一致，认为多酚物质的抗氧化能力与组分的变化也有显著关系。

表3 芽长与绿豆多酚含量及抗氧化活性的关系

3 结论

本实验以绿豆为原料，通过测定多酚含量、组成及抗氧化能力来考察绿豆在发芽过程中多酚化合物的变化情况，结果发现绿豆在发芽过程中多酚含量、组成及抗氧化活性均有显著的变化。在芽长4～5 cm时，绿豆芽多酚含量达到最高并且表现出最佳的抗氧化活性，多酚含量较未发芽前提高了38%，绿豆芽多酚对DPPH、羟自由基的清除能力及总抗氧化能力分别达到93.82%、93.90%、8.32 U/mg，相比于发芽前提高了8.8%、34%、17.4%，该时期绿豆芽多酚化合物种类最为丰富，大豆苷元、香豆雌酚相对质量分数较高。因此绿豆芽长在4～5 cm时，可以最大程度提高绿豆芽多酚含量及抗氧化活性，并丰富绿豆芽多酚组成，该结果可以为以后绿豆芽多酚活性物质的研究提供参考。