基于细胞介导的免疫应答观察逐水饮治疗肺癌胸腔积液疗效及机制探究

何 婷,刘晓芳

(1.大连市中医医院，辽宁 大连 116013；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

恶性胸腔积液(Malignant pleural effusion,MPE)作为肿瘤进入晚期的恶病质变现，是肿瘤患者的常见并发症之一和主要死亡原因。MPE可来源于原发胸膜的恶性肿瘤，或是胸膜因肺癌、其他部位恶性肿瘤侵犯所导致。几乎所有的恶性肿瘤均可引发MPE，其中肺癌是最常见的诱发病因，乳腺癌和淋巴瘤次之，上述常见的病因约占MPE的75%[1]。MPE的出现是危险信号提示，表明患者病情已经进入晚期阶段或肿瘤发生扩散，患者的预期寿命将明显缩短。由于胸膜内大量积液进行性的增加，使患者出现呼吸困难、胸部钝痛、干咳等症状，不仅给患者带来身体的痛苦也极大影响日常生活，若病情未能得到有效控制则会出现心肺衰竭而危及生命[2-3]。临床上针对MPE有多种治疗方法的选择，但是药物治疗存在副作用或发热、剧烈疼痛等问题，手术治疗需要匹配适合的患者且面临手术风险。所以寻找可以缓解MPE患者临床症状，尽量减少治疗过程中给患者造成的痛苦，提高生活质量及延长患者生存时间的治疗方法是迫切需求的[4-5]。从中医角度出发，MPE多属“悬饮”范畴，癌毒侵袭机体，日益渐盛，人体正气渐虚，气血阴阳亏虚，津液输布失常，水饮闭阻于胸肋乃致本病[6]。目前中医药治疗MPE显示出一定疗效，故本研究构建小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型，采用中药逐水饮进行干预，以期观察基于细胞介导的免疫应答对模型小鼠的疗效以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞株：本研究中的实验动物均为清洁级雄性C57BL/6小鼠，共85只，在6～8周龄，体重范围是16～24 g，由黑龙江中医药大学实验动物研究所提供，动物使用许可证号SYXK(黑)2016004。饲养环境如下：温度和相对湿度分别保持在21～25 ℃和50%～60%，每日对饲养室适当通风换气，保持昼夜各12 h。小鼠Lewis肺癌瘤株购自上海心语生物科技有限公司。

1.1.2 实验药物与试剂：逐水饮是黑龙江中医药大学附属二院在临床治疗MPE的经验总结药方，具体组成如下：黄芪、葶苈子、白花蛇舌草各20 g，猪苓、茯苓、桑白皮、莪术各15 g，甘草12 g，大枣、浙贝母、麦冬各10 g。上述所有药材在纯净水中浸泡30 min，使用5倍水量进行煎煮，共煎煮2次，过滤后将所有药液混合在一起，通过蒸发将药液浓缩成1 g生药/ml药液，存放于4 ℃冰箱中待后续使用。顺铂注射液由杭州民生药业集团有限公司提供。小鼠Lewis肺癌瘤株，购自上海心语生物科技有限公司；胎牛血清，购自HyClone公司；小鼠转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自Abcam公司(批号 ab86349)；小鼠CTLA-4的ELISA试剂盒购自Abcam公司(批号 ab255720)。

1.1.3 实验仪器：电热恒温水浴锅(型号：DZKW-D-2)购自黄骅光明实验仪器设备有限公司；二氧化碳培养箱(型号：ICA175)购自北京安捷来勒科技有限公司；培养用倒置生物显微镜(型号：NIB620)购自宁波永新光学股份有限公司；精密天平(型号：FA3204B)购自上海天美天平仪器有限公司；流式细胞仪(型号：CytoFLEX)购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立：本研究构建的胸腔积液小鼠模型参考Theodora等[7]和周恺骅等[8]实验研究并且加以改良。首先进行细胞的复苏，将装有Lewis肺癌细胞的冻存管置于37 ℃恒温水浴锅中迅速融化，吸取细胞悬液于15 ml离心管中，加入10%胎牛血清DMEM培养基，然后进行1000 r/min转速，离心5 min，弃上清液，加2 ml的10%胎牛血清DMEM培养基将细胞均匀吹散，培养基加至10 ml，置于37 ℃，5%的CO2培养箱内，24 h后进行换液。细胞生长到80%～90%融合时进行传代，2～3 d传代1次。收集处于对数生长期生长状态良好的细胞且台盼兰试验测定细胞活性>90%，将细胞浓度调整至5.0×106/ml。接种前将85只小鼠右侧胸部皮肤进行消毒，随机选取68只小鼠在其右侧胸部近腋中线，大约与第6肋间隙持平的位置进行上述细胞悬液的胸腔注射，接种量为经过PBS调整浓度为2.5×106/ml的细胞悬液0.2 ml。

1.2.2 实验动物分组与给药：将这68只模型小鼠随机分四组，分别为模型组、逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组，各17只；剩余17只小鼠相同位置予0.9%氯化钠溶液进行胸腔注射，为空白参照组。空白参照组常规方式喂养，不给予干预方法。68只模型组Lewis肺癌细胞胸腔积液模型小鼠造模第4 天开始进行药物干预，模型组不给予药物干预。逐水饮组：小鼠的给药量为33.5 g/(kg·d)的中药逐水饮药液，给药体积为0.2 ml，1次/d。顺铂组：先将用9 L的0.9%生理盐水将顺铂注射液进行稀释6 mg/(kg·d)的标准予小鼠腹腔注射，给药次数为每3天1次。逐水饮联合顺铂组：27 g/(kg·d)中药逐水饮药液，以2 ml灌胃体积给药，1次/d，同时合用腹腔注射6 mg/(kg·d)顺铂，每3天1次。建立模型当天为第1、4天开始给药干预，每一组的给药时间均为10 d。

1.2.3 实验动物取材：建立模型的第14天开始取材，每组取出10只小鼠，行眼球取血，使用肝素抗凝，另取血样1 ml室温放置2 h后进行离心(2000 r/min)，收集血清存放于-80 ℃。同时解剖小鼠收集MPE，测量并记录MPE体积。各组剩余的7只小鼠用于生存期的观察。

1.2.4 实验动物MPE体积、胸壁转移瘤个数以及生存天数：MPE体积、生存期上文已描述方法。胸壁转移瘤个数采用解剖显微镜进行观察，两位实验人员分别独立观察并记录小鼠前、侧、后胸壁的转移瘤个数。

1.2.5 实验小鼠外周血Th17、Treg细胞的流式检测：取各组小鼠的肝素抗凝外周血100 μl，Th17、Treg分别进行相应同型抗体的染色，如下：CD4-FITC、IL-17A-PE、CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE染色，严格按照说明书要求操作，最后在流式细胞仪进行检测。

1.2.6 ELISA测定小鼠外周血中TGF-β1以及CTLA-4含量：取保存于-80 ℃的血清样本，分别严格依据小鼠TGF-β1试剂盒和小鼠CTLA-4试剂盒的操作步骤对指标进行测定。

2 结 果

2.1 各组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤个数以及生存天数比较 通过10 d的药物干预后，各组小鼠的MPE体积、胸壁转移瘤个数以及生存期均有变化。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组小鼠的MPE体积均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组小鼠的胸壁转移瘤个数均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组小鼠的生存天数均延长，差异有统计学意义(P<0.05)。与顺铂组比较，逐水饮组在MPE体积、胸壁转移瘤个数以及生存期方面差异均无统计学意义(P>0.05)。与逐水饮组、顺铂组比较，逐水饮联合顺铂组在MPE体积的减少、胸壁转移瘤个数的减少以及生存期方面，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠MPE体积、胸壁转移瘤个数以及生存天数比较

2.2 各组小鼠外周血Th17、Treg细胞数量变化情况比较 与空白参照组比较，其他各组小鼠Th17细胞数量均高，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组的Th17细胞数量与模型组比较均高，差异有统计学意义(P<0.05)，且逐水饮联合顺铂组升高程度最大。顺铂组Th17细胞数量与逐水饮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与逐水饮组、顺铂组比较，逐水饮联合顺铂组Th17细胞数量均高于这两组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组Treg细胞数量均高于空白参照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组的Treg细胞数量均低，差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂组Treg细胞数量与逐水饮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；逐水饮联合顺铂组Treg细胞数量均低于逐水饮组、顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠外周血Th17、Treg细胞数量比较(%)

2.3 各组小鼠外周血中TGF-β1、CTLA-4含量比较 与空白参照组比较，其他各组的TGF-β1水平均有升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且模型组升高程度最大。与模型组比较，逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组的TGF-β1水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。顺铂组TGF-β1水平与逐水饮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。逐水饮联合顺铂组TGF-β1水平均低于逐水饮组、顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白参照组比较，其余各组的CTLA-4水平均有升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，且模型组升高程度最大。逐水饮组、顺铂组、逐水饮联合顺铂组的CTLA-4水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。顺铂组CTLA-4水平与逐水饮组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。逐水饮联合顺铂组CTLA-4水平低于逐水饮组、顺铂组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠外周血中TGF-β1、CTLA-4含量及比较

3 讨 论

MPE是胸膜受到恶性肿瘤的侵害而引发胸膜腔液异常增多及集聚，恶性肿瘤可以是原发性的也可是肺癌、乳腺癌等其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜[9]。MPE作为晚期恶性肿瘤的常见且难以控制的并发症，在全部胸腔积液中的比例可以达到18%～32%。相关调查统计我国每年有MPE患者20万左右，在全部胸腔积液患者中的比例大约为40%[10-11]。胸腔处积液的集聚以及迅速发展压迫肺组织，会机械性限制肺扩张，直接影响心肺功能或肺部因引流不畅而导致感染，所以常造成患者呼吸功能障碍、循环障碍等。临床中患者一旦出现MPE，则是疾病进入晚期的标志，此时有效减缓积液增长、改善呼吸困难、胸闷、胸痛等临床症状、在延长患者生存时间的同时提高患者的生活质量是治疗的首要任务[12-13]。传统医学从调节机体免疫功能、调控免疫炎症微环境、促进胸膜黏连等多途径对MPE进行干预，在疗效和安全性方面也呈现出鲜明的优势。可以作为晚期肿瘤、体弱年老，尤其不能接受手术治疗等患者的首选治疗方法[14]。

传统医学根据MPE的病位和临床表现将其归属于“悬饮”，《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》中曾有记载“饮后水流胁下，咳唾引痛”该描述正与现代医学的MPE的病位和症状相似。传统医学认为正气虚衰是MPE的发病根本，邪毒侵犯是致病因素。正气虚弱则气血阴阳失和，津液输布不畅，水液集聚为悬饮，或正虚易感邪毒，与停聚的水液相互搏结，阻塞三焦水道，乃成本病[15-16]。对于MPE的中医治疗要重视祛邪和扶正同时兼顾。本研究中应用的中药处方逐水饮是黑龙江中医药大学附属二院在临床治疗MPE的经验方。方中黄芪善于补脾益气，葶苈子、桑白皮有泻肺平喘、利水之功效，白花蛇舌草可以解毒抗肿瘤，猪苓、茯苓可淡利水湿，茯苓又有健脾补中之功，莪术长于行气活血，畅通血脉，使水液通道顺畅又可抗癌，浙贝和麦冬长于养阴润肺，大枣有扶正调和之功，防止方内诸药克耗正气，甘草意在调和诸药。全方健脾、行气、活血、利水、抗癌又兼顾扶正[17-18]。本次研究发现，与模型组比较，逐水饮组、顺铂组以及逐水饮联合顺铂组MPE体积均减少、胸壁转移瘤个数均减少、生存天数均延长，表明中药处方逐水饮和顺铂在抑制MPE生成和肿瘤生长方面均有一定的效果，且逐水饮联合顺铂组在这些方面的改善情况均优于单独使用逐水饮和单一使用顺铂，表明逐水饮配合顺铂同时使用对MPE的治疗效果更加显著。李政等[19]在晚期非小细胞肺癌伴恶性胸水的患者治疗中将葶苈甘遂逐水饮应用其中，结果发现相比于单纯应用胸腔内灌注化疗，联合葶苈甘遂逐水饮能够更好的改善患者症状，有效抑制胸水的生成。本研究结果与李政等研究结果基本一致。

肿瘤细胞的局部微环境是密切参与MPE从生成到发展过程的，且免疫细胞是重要部分。CD4+T细胞和CD8+T细胞主要介导机体的免疫细胞，而Th17细胞是发现于CD4+T细胞的新效应性细胞亚群。正常生理状态下，Th17细胞和Treg细胞应处于平衡状态，已有研究证实Th17细胞和Treg细胞与MPE的发生发展息息相关[20-21]。王兵等[22]发现Lewis肺癌MPE的模型小鼠外周血Th17细胞水平降低而Treg细胞水平升高，出现了Th17/Treg失衡。本研究发现，与模型组相比，逐水饮组、顺铂组以及逐水饮联合顺铂组的Th17细胞表达均有升高，Treg细胞表达均降低，其中逐水饮联合顺铂组的Th17升高、Treg下降变化最明显，提示模型组小鼠免疫功能受损，由Th17细胞占优势转向Treg细胞的高表达，使Th17/Treg平衡受到破坏，而使用中药逐水饮、顺铂进行干预均可以纠正Th17/Treg失衡，逐水饮联合顺铂同时干预效果更优。TGF-β对于调节初始CD4+T细胞分化有着关键作用，且CD4+T细胞向Th17细胞分化或者向Treg细胞分化依赖于TGF-β的表达浓度[23]。本研究发现，与模型组相比，逐水饮组、顺铂组以及逐水饮联合顺铂组的TGF-β表达均降低，其中逐水饮联合顺铂组的TGF-β表达降低最显著。提示中药逐水饮、顺铂进行干预均使TGF-β低表达，从而诱导CD4+T细胞向Th17方向分化，调节免疫反应进而治疗MPE，逐水饮联合顺铂治疗效果更优。CTLA-4会抑制T细胞的激活；通过刺激TGF-β的分泌会导致T细胞增殖途径受阻；抑制细胞因子的产生,抑制T细胞的增生，这些机制会增强肿瘤的耐受性，使机体的抗肿瘤能力降低[24]。本研究结果显示，与模型组相比，逐水饮组、顺铂组以及逐水饮联合顺铂组的CTLA-4水平均降低，其中逐水饮联合顺铂组的CTLA-4水平降低最显著。提示使用中药逐水饮、顺铂可以有效抑制CTLA-4表达，改善机体免疫功能，抑制肿瘤细胞逃避免疫监视。周立云等[25]对于恶性胸水患者，在治疗组加用了自拟扶正逐水饮，结果显示与对照组相比，加用自拟扶正逐水饮在控制胸水和改善患者免疫功能方面均取得了更好效果，与本研究结果相似。

综上所述，中药逐水饮通过使Th17细胞高表达、Treg细胞低表达及调控相关细胞因子使Th17/Treg达到平衡状态，增强机体免疫功能，纠正免疫缺陷，抑制癌细胞逃逸，以此缓解胸腔积液情况，且逐水饮联合顺铂治疗效果更显著。