miR-28-5p对结肠癌细胞增殖和迁移的影响*

朱庭沛，桂裕昌，覃慧晴，陈建泉，唐云，许建文

（1.广西医科大学第一附属医院 康复医学科，广西 南宁 530021；2.广西中医药大学 第一临床医学院，广西 南宁 530021）

结肠癌（colon cancer）是一种常见的消化道恶性肿瘤，据我国2018 年癌症统计报告显示，相较2015 年，结肠癌的发病率已由第五位上升至第三位，死亡率仍维持在第五位［1］。我国已成为全球结肠癌每年新发病例和死亡病例数最多的国家。结肠癌的发病率逐年显著上升，且多数病人在确诊时已属于中晚期。目前针对结肠癌的治疗手段以外科手术结合放化疗为主，虽有一定治疗成效，但肿瘤的复发和远处转移严重影响患者的生存率［2］。因此，探寻结肠癌的发病机制，提高结肠癌早期诊断率，寻找新的治疗靶点迫在眉睫。

微小RNA（miRNA）是一类由19～23 个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA，它通过碱基互补配对方式与靶基因的3'非翻译区（3'-UTR）互补位点特异性结合，从而在转录后水平对靶基因的表达进行调控［3］。研究表明，miRNA 在不同条件下是一把双刃剑，既可以作为癌基因致病，也可以作为抑癌基因对机体起到保护作用［4-5］。miRNA 对肿瘤的发生发展起着重要的影响，包括维持增殖信号、逃逸生长抑制因子、抵抗细胞死亡、激活侵袭和转移以及诱导血管生成等［6］。近年各项研究发现，miR-28-5p 在食管癌、乳腺癌、淋巴瘤与胶质瘤中均有抑癌作用［7-10］，但有关miR-28-5p 对结肠癌生物学作用的影响尚少见报道。本研究旨在探讨miR-28-5p 对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响，为结肠癌的临床防治提供新的研究方向和选择。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人正常结肠细胞NCM460 以及人结肠癌细胞株HCT116、SW480、SW620 均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，胎牛血清购自依科赛生物科技（太仓）有限公司，RMPI-1640培养基购自美国Gibco 公司，lipofectamine 3000 购自美国Invitrogen 公司，miR-28-5p 过表达与沉默siRNA （miR-28-5p mimic and miR-28-5p inhibitor）由韩国Bioneer 公司合成，CCK 盒购自美国Abmole 公司，NucleoZOL 试剂盒购自德国MACHEREY-NAGEL 公司，逆转录试剂盒（638313）、实时荧光定量试剂盒（RR820A）及相关引物均购自日本Takara 公司，其余细胞培养材料均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，37℃细胞培养箱购自美国赛默飞世尔科技公司，倒置显微镜购自尼康映像仪器销售（中国）有限公司，NanoDropTMOne 超微量核酸蛋白浓度测定仪购自美国赛默飞世尔科技公司，QuantStudioTM5 全功能定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司，酶标仪购自德国Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 NCM460、HCT116、SW480、SW620 细胞均置于37℃，5%CO2培养箱中，使用含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素混合液的RPMI-1640 培养基进行培养。将HCT116、SW480、SW620 三种细胞株各分为三组：对照组、过表达组、沉默组，其中对照组不予特殊处理，过表达组、沉默组取对数生长期细胞分别转染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，转染步骤依据lipofectamine 3000 试剂盒说明书进行，并根据转染效率优化方案。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应 使用NucleoZOL试剂盒提取各组细胞总RNA，NanoDropTMOne 检测总RNA 浓度，逆转录试剂盒合成cDNA（37℃1 h，85℃5 min），PCR 反应体系与反应条件依据试剂盒说明书设置。基因的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。U6 作为内参，引物序列详见表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.3 CCK8 法检测细胞增殖 将转染后的各组细胞接种于96 孔板中，每孔加入100 μL 细胞悬液（1×104个细胞），每组设置5 个复孔，置于37℃培养箱中分别培养12 h、24 h、48 h。随后去除原有培养基，每孔加入90 μL 完全培养基和10 μL CCK8 试剂（确保无气泡生成），37℃环境下孵育1 h 后，使用酶标仪检测450 nm 处的光密度（OD）值。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移 将转染后的各组细胞接种于6 孔板中，待细胞铺满6 孔板底部后，每孔用无菌10 μL 枪头轻划三条垂直竖线，用常温无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次，随后加入2 mL 完全培养基，分别于0 h、48 h 显微镜下拍照，使用ImageJ 软件分析划痕面积，计算划痕迁移率=（0 h 面积-48 h 面积）/0 h 面积。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-28-5p 在不同结肠癌细胞中的表达差异

培养NCM460、HCT116、SW480 和SW620 细胞，采用qRT-PCR 检测miR-28-5p 在各细胞中的相对表达量，结果显示，miR-28-5p 在结肠癌细胞HCT116、SW480 和SW620 中的相对表达量均低于正常结肠细胞NCM460，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 miR-28-5p 在不同细胞中的相对表达量

2.2 miR-28-5p 对结肠癌细胞增殖的影响

将HCT116、SW480 和SW620 三种细胞各分为三组：对照组、过表达组、沉默组。对照组不予处理，过表达组和沉默组分别转染miR-28-5p mimic 和miR-28-5p inhibitor，采用qRT-PCR 检测miR-28-5p 在各组细胞中的相对表达量，结果显示，与对照组相比，miR-28-5p 在过表达组中的相对表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），在沉默组中的相对表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），证明转染成功。见图2。

图2 miR-28-5p 在不同转染后结肠癌细胞中的相对表达量

2.3 miR-28-5p 对结肠癌细胞迁移的影响

划痕实验结果显示，相较于对照组，HCT116、SW480 和SW620 三种结肠癌细胞中过表达组细胞的迁移能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），沉默组细胞的迁移能力均增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.4 miR-28-5p 对结肠癌细胞增殖的影响

CCK8 检测结果显示，12 h 时，三种结肠癌细胞中各组细胞间OD 值差异无统计学意义（P＞0.05）。24 h、48 h 时，相较于对照组，三种结肠癌细胞中过表达组细胞的OD 值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表明其增殖能力下降；沉默组细胞的OD 值均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明其增殖能力增强。见表3。

表2 各组细胞划痕迁移率比较 （,%）

表2 各组细胞划痕迁移率比较 （,%）

注：†与对照组比较，P＜0.05。

表3 各组细胞增殖能力检测结果比较 （）

表3 各组细胞增殖能力检测结果比较 （）

注：†与对照组比较，P＜0.05。

3 讨论

结肠癌是女性第二大常见癌症和男性第三大常见癌症，约占全球每年新确诊癌症总数的10%。因其发病较隐匿，早期临床症状常以腹胀等不典型症状为主，以至于患者未引起重视，导致早期确诊困难，约有50%的患者在就诊时已发生结肠癌的远处转移［11］，错过了最佳的治疗时机，据统计结肠癌的全球死亡率高达40%以上［12-13］。虽然结肠癌的手术方式，放化疗手段日益进展，但此类患者术后的五年存活率仍不足65%［14］。因此，早期确诊结肠癌至关重要。随着肿瘤生物学的发展，相关科研人员与临床医生都迫切希望从基因或分子层面探究结肠癌的病因与发生机制，寻找结肠癌早期诊断的靶标，从而使患者获益。

人们对miRNA 认识的不断深入，其对肿瘤的调控作用逐渐成为研究热点［15］，基于miRNA 与结肠癌相关性的研究也越来越多。2017 年，FENG等［16］发现过表达的miR-590-3P 可以促进结肠癌细胞的恶性增殖。随后ZHU 等［17］的研究结果显示，miR-873-5p 可以通过抑制TUSC3/AKT 通路抑制结肠癌细胞的生长。2019 年，DEHGHAN 等［18］最新研究表明miR-21 可作为早期结肠癌的诊断标记物，尤其是男性结肠癌。诸多相关研究均提示miRNA 与结肠癌的发生发展有着密不可分的联系，但有关miR-28-5p 在结肠癌中的作用研究还少见报道。

miR-28-5p 作为miRNA 家族中的一员，在肾癌、卵巢癌和前列腺癌中均可发挥抑癌作用［19-21］，与此同时，miR-28-5p 在消化系统肿瘤中的作用也不断被研究证实。HAN 等［22］研究表明，过表达的miR-28-5p 会促进胰腺癌的发展。XIAO 等［23］发现，miR-28-5p 可以通过抑制AKT 磷酸化从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。近期有研究结果显示［24］，miR-28-5p 可以通过IGF-1 途径调节肝癌干细胞的增殖。在本研究首先通过qRT-PCR 实验证实了miR-28-5p 在HCT116、SW480、SW620 三类结肠癌细胞株中的表达量均显著低于正常结肠细胞，提示miR-28-5p 可能参与结肠癌发展的相关调控。随后通过siRNA 转染技术沉默和过表达HCT116、SW480、SW620 三类结肠癌细胞中miR-28-5p 的表达水平，再通过CCK8 实验和划痕实验发现，在三类miR-28-5p 过表达的结肠癌细胞中，细胞增殖能力和迁移能力均降低，而在三类miR-28-5p 沉默的结肠癌细胞中，细胞增殖能力和迁移能力均增强。

综上所述，本研究初步探讨了miR-28-5p 对结肠癌细胞的生物学影响，结果提示miR-28-5p 具有调控结肠癌细胞增殖和迁移的作用，从而参与结肠癌的发生、发展及转移。未来我们将进一步深入探讨其作用机制。miR-28-5p 有望成为结肠癌新的生物标志物和治疗靶点，为结肠癌的防治提供新的思路。