典型雷特综合征疾病严重程度与临床特征和结构磁共振灰白质参数的相关性分析

朱国青 李慧萍 王均波 张 颖 鲁 萍 朱 叶 张凯峰 潘学霞 乔中伟 徐 秀 李冬蕴 徐 琼

雷特综合征(RTT; OMIM 312750)是一组主要由X染色体上的甲基化CpG结合蛋白2(MECP2)基因变异引起的神经发育障碍性疾病, 呈X连锁显性遗传[1, 2]。根据临床表现分为典型和非典型RTT[2, 3]。典型RTT 95%由MECP2基因变异引起，而非典型RTT主要与CDKL5基因(OMIM*300203) 和FOXG1基因(OMIM*164874)变异有关[4, 5]。MR近年来越来越多地被应用于发育障碍疾病神经机制研究中，是活体无创性研究大脑结构及功能的主要手段。既往结构MR研究发现RTT患者大脑灰质及白质均存在全局性及区域性的异常[6, 7]，说明大脑灰质及白质的结构对于解释RTT临床特征及发病机制具有重要意义[8, 9]。本文基于典型RTT探讨RTT严重度量表(RSSS)[13]与Griffiths精神发育量表-中文版(GDS-C)[14]、儿童睡眠习惯问卷(CSHQ)[15]和结构MR相关性，以期为RTT的神经病理学发病基础提供线索，对于RTT诊疗及远期预后具有一定的指导意义。

1 方法

1.1 研究设计 横断面调查的相关性分析。基于典型RTT病例，以RSSS为因变量，以GDS-C各能区发育商、CSHQ总分、脑灰白质MR参数为自变量，行多元线性回归分析。

1.2 典型RTT诊断标准[2]RTT诊断标准中有4项主要标准和11项支持标准，典型RTT诊断需同时满足4项主要标准：①已习得的目的性手技能部分或完全丧失，②已习得的口语能力部分或完全丧失，③步态异常：能力受损(运用障碍)或没有能力，④手刻板动作，例如绞手/紧握手、拍手/轻敲手、吃手、洗手/搓手样动作。

1.3MECP2基因检测 血标本处理、测序、变异分析和结果解读均参照复旦大学附属儿科医院(我院)分子诊断中心建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程2.0[13]。MECP2基因测序：PCR扩增检测MECP2基因编码区外显子。 基因组DNA多重连接探针扩增技术(MLPA)：使用由荷兰(MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands)生产的P015C试剂盒检测MECP2基因的拷贝数变异(基因缺失/重复)。

1.4 病例纳入标准 同时满足以下4项。①2014年7月至2021年6月于我院儿保科诊断为典型RTT的连续病例，②存在MECP2致病性变异，③行头颅MR常规扫描检查，④行GDS-C、RSSS评估和CSHQ问卷调查。

1.5 伦理和知情同意 本文为国家自然科学基金(项目编号：81701129，82171540)和上海市临床重点专科(项目编号：shslczdzk02903)项目，项目通过我院伦理委员会批准，批准文号：复儿伦审[2014125号]。患儿家长均签署基因检测和MR检查知情同意书。

1.6 行为评估和临床分期 行为评估包括：RSSS、GDS-C和CSHQ，RSSS和GDS-C评估均由我院至少2名儿童保健科医生完成，测评结果取平均值，CSHQ为家长问卷调查，均与MR检查相距≤1个月完成；RTT临床分期由儿童保健专科医生评估。

1.6.1 RSSS 包括抽搐发作频率及控制情况、呼吸异常、脊柱侧弯、行走能力、手的功用、语言、睡眠7个参数，每个参数评分范围从0(缺失/正常)至3(严重)，总分最大值为21分(最严重)。

1.6.2 GDS-C 包括总发育商和5个分能区(粗大运动、个人-社会能力、语言、手眼协调和表现)发育商。发育商=发育月龄/实际月龄×100%。

1.6.3 CSHQ 从8个维度反映儿童常见睡眠问题：就寝习惯不良、入睡潜伏期延长、睡眠持续时间不规律、睡眠焦虑、夜醒、异态睡眠、睡眠呼吸障碍、白天嗜睡。总评分>41 分即为睡眠质量不良，评分越高表示睡眠质量越差。

1.6.4 RTT临床分期[14]Ⅰ期：发病早期停滞期，通常出现在生后6～18个月，可持续数周至数月甚至≥1年；Ⅱ期：发育快速倒退期，通常从1～4岁开始，可持续数周至1年；Ⅲ期：假性稳定期，通常从2～10岁开始，可持续数年至10年；Ⅳ期：晚期运动恶化期，通常从10岁后开始至成年，可持续数年或数十年。

1.7 MR检查 使用GE Discovery MR750 3.0T磁共振机进行扫描，线圈为头颅32通道矩阵线圈，扫描序列为T1加权序列(T1 BRAVO)及DTI序列(SE-EPI)。在扫描前于我院镇静中心在医生监管下给予口服10%水合氯醛(50 mg·kg-1)且待患儿熟睡后行影像学检查。T1 BRAVO扫描参数：TR 8.2 ms，TE 3.2 ms，FOV 256 mm，矩阵256×256，像素1 mm×1 mm×1 mm，间距0；DTI SE-EPI序列扫描参数：TR 4 600 ms，TE 87.4 ms，FOV 240 mm，矩阵128×128，像素2 mm×2 mm×4 mm，间距0，b值分别0、1 000 s·mm-2，弥散敏感梯度方向15个方向。

1.8 MR影像数据处理 影像数据由我院儿童神经影像专业人员处理。将图像原始Dicom格式转换为nii格式，使用MRIcron软件(www.mricro.com)检查图像质量，剔除伪影、错层等缺陷的被试。对于T1加权数据，使用基于MATLAB R2014b运行环境采用统计参数图(SPM)10 软件(https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm10)进行分析，通过配准、组织分割、平滑的全脑体积标准流程处理后，获得全脑体积(TIV)、灰质体积(GMV)及白质体积(WMV)。对于DTI数据使用FSL软件中的FDT工具包对DTI图像进行校正，使用DTIFit工具包计算得到DTI图像的相关参数，包括各向异性(FA)：反映水分子各向异性成分占整个弥散张量的比例，间接反映白质纤维束的完整性，其值越低提示纤维束越不完整性；平均弥散量(MD)：反映分子整体弥散水平及细胞细胞膜密度，其值越高说明细胞膜密度越低；径向弥散率(RD)：可能提示髓鞘完整性，其值越高提示髓鞘完整性越低；轴向弥散率(AD)：反映轴索完整性，其值越高提示轴索完整性越低。

1.9 统计分析 描述性分析包括连续数据的平均值和标准差，应用SPSS 26.0进行多元线性回归分析，显著性级别(单尾)设置为0.05。

2 结果

表1 22例典型RTT患儿MECP2不同基因型的临床表型及临床严重程度

2.2 临床严重程度、发育水平及睡眠障碍情况 22例典型RTT患儿，①RSSS均值为(5.91±1.38)分；②临床分期为Ⅱ～Ⅲ期；③GDS-C总发育商为17.9±7.9，运动能区发育商为33.2±13.3，个人-社会能区发育商为17.5±9.3，语言能区发育商为15.0±8.6，手眼协调能区发育商为12.6±7.8，表现能区发育商为11.2±6.8；④CSHQ总分为(54.0±5.5)分，平均睡眠时间为(8.7±1.1)h，异常维度个数为(6.9±1.0)个，睡眠总分最小值为43(>41)分，均存在睡眠质量不良。

2.3 MR影像结果 22例典型RTT患儿，TIV=1 118.3±102.1，GMV=566.5±53.8，WMV=287.6±38.0；白质DTI参数FA=0.183 5±0.007 9，MD=0.001 1±0.000 1，RD=0.001 2±0.000 1，AD=0.001 0±0.000 1。

2.4 相关性分析 以RSSS为因变量，以GDS-C发育商和5个分能区发育商，CSHQ总分，MR参数TIV、GMV、WMV、FA、MD、RD及AD为自变量，多元线性回归分析结果(图1)显示，RSSS与GDS-C的个人-社会能区发育商(r=-0.518,P=0.007)、手眼协调能区发育商(r=-0.4,P=0.032)、总发育商(r=-0.429,P=0.023)，MR参数的GMV(r=-0.571,P=0.003)、WMV(r=-0.514,P=0.007)、FA(r=-0.472,P=0.013)、MD(r=0.519,P=0.007)、RD(r=0.528,P=0.006)、AD(r

图1 以RSSS为因变量的相关分析示意图

3 讨论

本研究中22例典型RTT均存在MECP2基因致病性变异，主要位于exon4及exon3，且大部分位于exon4。蛋白质结构主要位于甲基结合域(MBD)及转录抑制域(TRD)。22例患儿平均年龄(3.1±0.8)岁，均处于Ⅱ～Ⅲ期，RSSS为(5.91±1.38)分，GDS-C总发育商为17.89±7.93，CSHQ总分为(54.0±5.5)分，均存在睡眠质量不良。

既往临床表型研究报道RTT患儿存在不同程度的发育落后[2, 15]。本研究中相关分析结果显示，RSSS与GDS-C的总发育商及个人-社会能区、手眼协调能区发育商呈显著负相关，提示发育程度越落后，临床严重程度越重。此外，睡眠障碍严重影响RTT患儿及其家人的日常生活质量[16]，本研究中22例RTT患儿均存在睡眠质量不良，可解释睡眠模式受损属于典型RTT诊断的支持标准。

既往报道RTT患者MECP2变异大部分位于exon4，可能是因为它是该基因最大的外显子，并编码MECP2蛋白的重要结构域[17]。本研究中大多数致病变异与既往文献报道类似，发生在CpG热点的C>T转变，包括c.316C>T、c.382C>T、c.397C>T、c.455C>G、c.473C>T、c.502C>T、c.602C>T、c.763C>T、c.808C>T、c.880C>T及c.916C>T。除了热点区域的致病性变异，RTT也存在C末端的插入或缺失导致的移码变异和早期截断[18]。本研究中单碱基重复致移码变异c.753dupC 1例(例14)、缺失变异c.1454_1457del 1例(例21)。另外，本研究中有1例(例22)MECP2基因测序未检测到致病性变异，但MLPA检测到exon4缺失。

另外，不同的基因型所呈现的临床症状严重程度也不同。既往大样本基因型及表型相关性研究采用疾病临床严重度评分(CSS)发现p.R133C、p.R294X、p.R306C、exon1 del和3'截断变异的分数较低，而p.R106W、p.R168X、p.R255X、p.R270X、剪接位点、大缺失、插入和缺失的分数较高[19]。本研究使用特异性RSSS发现p.R133C(5分)及p.R306C(4.7分)分数偏低，提示临床症状轻；p.R255X(7分)及p.R270X(6分)分数偏高、缺失变异c.1454_1457del TTAG(8分)及大片段缺失exon4 del(10分)分数较高，提示临床症状重，与文献报道一致。

RTT患儿存在头围减少和脑容量减少，既往影像学研究发现，灰质脑容量的减少多在枕叶及顶叶后部，呈区域性分布，而大脑白质容量则呈整体性的减低[8, 9]，但尚无与RTT疾病严重程度的相关性探讨。本研究相关性分析提示，典型RTT的RSSS与GMV、WMV以及白质的FA呈负相关，而与白质的MD、RD和AD呈正相关。本研究中灰白质参数与典型RTT的RSSS的显著相关性结果，提示典型RTT患儿脑灰质白质容量越小，其临床严重度越高；白质纤维束、髓鞘及轴索完整性越低，其临床严重度越高。此外，RSSS分值较低的变异，如p.R133C(GMV 574, WMV 305)及p.R306C(GMV 593, WMV 309)，比RSSS分值较高的变异，如c.1454_1457del TTAG(GMV 534, WMV 237)及exon4 deletion(GMV 445, WMV 249)，大脑灰白质容积较大。既往尚无对不同基因型与脑容量或脑结构异常的相关性研究。未来大样本的多序列的MR研究，可进一步证实不同基因型与疾病严重程度及脑结构及功能损伤的相关性。

本文不足：①本研究为横断面相关性研究，仅能反映典型RTT患儿RSSS与GDS-C、CSHQ和结构MR参数相关性，并不能反映关联程度，②样本量不足，③典型RTT患儿RSSS缺乏阶梯化的评估，不能更准确地反映典型RTT患儿RSSS程度。