异养小球藻细胞采收方法的研究

黄伟伟, 毕生雷, 杨迪, 刘雨, 辛纳慧, 李钰媛, 张乃群*

(1.南阳师范学院生命科学与技术学院, 河南 南阳 473061; 2.河南天冠企业集团有限公司, 车用生物燃料技术国家重点实验室, 河南 南阳 473003; 3.南阳农业职业学院, 河南 南阳 473000)

异养小球藻(heterotrophic Chlorella)生长速度是自养藻的40倍,生物量是自养藻的60倍，而且含油量高、占地面积小、可利用工业发酵装置进行集约化生产，被认为是生产生物柴油的良好原料[1]。微藻收集成本较高，一般占微藻生物柴油总生产成本的三分之一[2]。目前，藻类收集方法研究较多的是大型藻类、自养微藻类。规模化收集微藻主要使用工艺和设备均较成熟的离心法，但该方法能耗大、成本高[3]。目前，异养微藻细胞采收更多参考了生物发酵常用的细胞采收方法。

生物发酵中常用的细胞采收方法较多，包括自然沉降法、过滤法、离心法、磁选法、气浮法、微生物共生法、絮凝法等。自然沉降法是一种设备简单、操作成本低廉的采收方法，在发酵罐或其他辅助储罐中即可完成，但采收率仅30%[4]。由于异养小球藻细胞内油脂含量普遍高于50%，藻细胞密度小，不易沉降，通常需要1 d甚至数天才能完成，且采收效率过低。过滤法包括板框过滤和膜过滤，采收率均可达95%以上[5]，其中板框过滤是比较传统的采收方法，但需要添加大量助滤剂，而且藻细胞与助滤剂分离困难，不利于后期藻细胞内活性物质提取和利用；金属膜过滤是新兴的采收方法，但设备投资成本高，而且膜清洗需要使用大量酸碱，从而造成较大的环保压力。离心法是常规的固液分离方法，采收率可达99%[6]，一般认为离心法能够完全将藻细胞分离，但离心法能耗极大。磁选法和气浮法是近年来出现的新型采收方法，目前技术并不成熟，普遍存在操作过程要求苛刻、采收成本较高的问题。微生物共生法采收率仅44.78%[7],采收效率低、采收周期长达数天。而絮凝法不仅设备投资成本低、操作成本低，而且采收效率相对较高，可达90%[4]，通过筛选絮凝剂、优化絮凝工艺，完全有可能达到过滤法、离心法的采收效果。

絮凝法的作用机理是释放带电官能团吸附胶体、细胞，从而使细胞桥架成大团并沉降，可见絮凝剂实现絮凝效果的前提是能够与细胞接触、细胞之间桥架成团。如果絮凝剂添加量较少，絮凝剂不足以吸附全部胶体、细胞，那么就不能聚集成团并沉积；而如果絮凝剂添加量过多，每个细胞都被数个絮凝剂基团吸附、包裹，没有空间去桥架了，细胞之间可能就无法实现桥架、无法絮凝成团沉降[8]。絮凝法在收集细胞的同时，对细胞伤害极小，絮凝团内的细胞形态完好，游离细胞可保持良好的活性[9]，对后序提取工艺没有不良影响。研究表明，絮凝法能够使自养微藻收集成本降低68.8%[10]。按照所用絮凝剂的不同，絮凝法大致可以分为无机絮凝法、有机絮凝法、生物絮凝法。薛蓉等[11]研究表明，壳聚糖、琼脂等有机絮凝剂对自养小球藻没有任何絮凝作用，无机絮凝剂絮凝效果均比较理想；赵奎等[12]研究了8种絮凝剂对自养小球藻的影响，结果表明，氢氧化钙是最理想的絮凝剂，自养小球藻采收率可达97%。异养小球藻的藻细胞油脂含量高达50%以上，但藻蛋白含量仅15%左右。与自养小球藻相比，异养小球藻生物量较高、发酵液成分复杂，不仅含有培养基中残留的葡萄糖、酵母粉、营养盐等物质，还有大量的细胞碎片、胶体、代谢产物等物质，这些物质都是自养小球藻培养液没有的[13]。现有文献仅涉及异养小球藻的生物絮凝，其他絮凝方法尚未报道。因此，直接借鉴前人的研究可能无法获得理想结果。本研究在综合比较三氯化铁、硫酸铝絮凝法、壳聚糖絮凝法、聚丙烯酰胺絮凝法和霉菌吸附法的絮凝效果基础上，以采收率作为考察指标进行工艺优化，以期探索出适合异养小球藻发酵液的絮凝方法，为规模化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设备

异养小球藻藻种由清华大学生命科学学院提供。异养小球藻发酵液由河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室提供，异养小球藻发酵液由异养小球藻使用葡萄糖、酵母粉等原料发酵所得，发酵终了生物量为121 g·L-1、pH为6.3，发酵结束后经100 ℃灭菌、降温备用。三氯化铁、硫酸铝、壳聚糖、聚丙烯酰胺均为市售。黑曲霉(Aspergillusniger3.3928 ) 由河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室提供。

ME1002E型电子天平购自梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，WH220-HT数字式加热磁力搅拌器购自伊孚森生物技术(中国)有限公司，FE28-Bio型pH计购自于梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，XSP-9CA型显微镜购自上海光学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1絮凝剂的选择 无机絮凝法：取1 000 mL发酵液，分别置于5个500 mL小烧杯中，并分别加入0.5 g·L-1的三氯化铁、硫酸铝，在磁力搅拌器上以150 r·min-1的速率搅拌2 min后，静置80 min，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数[12]，并计算采收率。

有机絮凝法：取1 000 mL发酵液，分别置于5个500 mL小烧杯中，并分别加入0.5 g·L-1的壳聚糖、聚丙烯酰胺，在磁力搅拌器上以150 r·min-1的速率搅拌2 min后，静置80 min，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数，并计算采收率。

生物絮凝法：采用毕生雷等[7]的方法，在摇瓶发酵液中补充营养物质，并接入黑曲霉继续培养，直到霉菌吸附球不再增加为止，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数，并计算采收率。

1.2.2絮凝条件优化 影响絮凝的参数有絮凝剂添加量、搅拌速率、搅拌时间、沉降时间、pH等。对于沉降时间，絮凝后沉降一般在10 min内即可完成[14]，絮凝时间对采收率影响并不大；而调节pH将会使用额外的酸和碱，采收率较高的pH区间也往往处于中性范围[8]。因此，本研究着重考察絮凝剂添加量、搅拌速率、搅拌时间对采收率的影响。

①絮凝剂添加量对采收率的影响：取1 000 mL发酵液，分别置于5个500 mL小烧杯中，并分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1的絮凝剂，在磁力搅拌器上以150 r·min-1的速率搅拌2 min后，静置80 min，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数，并计算采收率。

②搅拌速率对采收率的影响：取1 000 mL发酵液，分别置于5个500 mL小烧杯中，并分别加入2.0 g·L-1的絮凝剂，在磁力搅拌器上以0、50、100、150、200 r·min-1的速率搅拌2 min后，静置80 min，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数，并计算采收率。

③搅拌时间对采收率的影响：取1 000 mL发酵液，分别置于5个500 mL小烧杯中，并分别加入2.0 g·L-1的絮凝剂，在磁力搅拌器上以150 r·min-1的速率分别搅拌0、10、20、40、80 min后，静置80 min，使用移液枪从烧杯中上部吸取适量液体测定细胞数，并计算采收率。

1.2.3响应面分析 根据单因素试验确定的主要影响因素，利用Design expert 8.0软件对絮凝剂添加量、搅拌速率、搅拌时间3个变量进行Box-Behnken-设计(表1)，然后利用响应面分析方法对结果进行回归模拟，确定最优絮凝条件。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3 数据分析

采用Origin 7.5软件绘图并进行数据分析，使用Design expert 8.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 絮凝剂的选择

图1显示了不同絮凝剂对异养小球藻的采收效果。从图1可知，三氯化铁、硫酸铝等无机絮凝法采收率普遍高于80%，其中，三氯化铁采收率最高。而壳聚糖、聚丙烯酰胺等有机絮凝法和霉菌吸附法采收率普遍低于40%。霉菌吸附效果一般，采收率仅为36.18%，原因可能是异养小球藻发酵时间长、发酵液中成分复杂，霉菌生长状况不太理想，异养小球藻细胞较小，霉菌丝无法形成致密的菌丝团包裹细胞。从表2可以看出，由于培养黑曲霉需要补充大量营养物质，导致霉菌法收集成本较高。而三氯化铁综合成本不足0.1元·kg-1。因此，经综合比较采收率和采收成本，本研究选用三氯化铁作为进一步的研究对象。

表2 不同絮凝剂的成本比较Table 2 Cost comparison of different flocculant

2.2 工艺参数对采收率的影响

2.2.1絮凝剂添加量对采收率的影响 图2显示了絮凝剂添加量对采收率的影响。从图中可以看出，随着絮凝剂添加量的增加，采收率不断提高。当絮凝剂添加量达到2 g·L-1时，采收率达到92.05%，但继续增加用量，采收率并没有明显提高。因此，本研究选择絮凝剂添加量为2 g·L-1。

2.2.2搅拌速率对采收率的影响 从图3可以看出，随着搅拌速率的提高，采收率快速增加，说明搅拌使絮凝剂、发酵液在容器中分布均匀、充分接触，从而在搅拌速率提高时采收率也得到相应提升。但搅拌速率超过150 r·min-1后，采收率反而有所下降。因此，本研究选择搅拌速率为150 r·min-1。

2.2.3搅拌时间对采收率的影响 图4显示了搅拌时间对采收率的影响。从图中可以看出，随着搅拌时间的延长，采收率快速提高。当搅拌时间达到20 min时，采收率达到94.6%，继续增加搅拌时间，采收率反而有所降低。因此，本研究选择搅拌时间为20 min。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1响应面模型的建立 以采收率为响应值进行响应面分析，测定结果见表3。利用软件建立回归模型，并选择最优变量。通过软件分析，进行二次多项式拟合，获得回归方程：采收率=93.1+1.40A+ 6.49B+0.44C-0.45AB-0.10AC-0.53BC-0.66A2-4.29B2-2.73C2。回归方程的相关系数R2为96.81%，校正后的R2为92.70%，说明试验可靠度高。而变异系数CV为0.96%，说明试验稳定性强，试验操作可信。总之，该回归方程为絮凝法收集异养小球藻提供了一个良好的模型。

表3 响应面分析结果Table 3 Results of response surface analysis

2.3.2响应面图及分析 根据二次回归方程，得到各因素交互作用对采收率的响应面图(图5)。响应面图包含响应面和等高线，通过等高线的密集程度及形状可以观察出交互作用的强弱，通过响应面的升降轨迹则可以观察出各因素值变动对采收率值的影响。从图5可知，因素A和因素B的交互作用、因素B和因素C的交互作用相当，而因素A和C的交互作用比因素A和B、因素B和C略微显著。从图5中还可以看出，随着因素A、因素B、因素C值的增加，采收率均呈现出先升高后又降低的趋势。

2.4 回归模型方差分析结果

从表4可知，絮凝剂添加量、搅拌时间对采收率影响均不显著，絮凝剂添加量、搅拌速率、搅拌时间各变量之间的交互作用不太明显。二项式模型选择的最优变量为絮凝剂添加量2.0 g·L-1、搅拌速率为150 r·min-1、搅拌时间20 min，此时理论采收率达到95.3%，与单因素试验结果保持一致，说明通过响应面分析获得的絮凝法收集工艺条件是可行的。在该采收率情况下重新测算三氯化铁絮凝法收集成本为0.07元·kg-1，具有实际应用价值，絮凝后异养小球藻在烧杯底部沉积明显，收集效果较好。

表4 回归模型方差分析结果Table 4 Results of regression model variance analysis

3 讨论

3.1 不同絮凝剂对采收率和采收成本的影响

与霉菌吸附相比，聚丙烯酰胺和壳聚糖的絮凝效果更差，采收效果不好。这与邹婷婷[15]的研究结果一致，可能是聚丙烯酰胺等絮凝剂更适应于污水中有机物和悬浮物的去除[16]。硫酸铝、三氯化铁的采收率较高，但低于薛蓉[17]的研究结果。原因可能是异养小球藻经过十几天的发酵，异养小球藻发酵液质量体积浓度高达121 g·L-1，远远高于自养小球藻的2 g·L-1，这导致溶液黏度过大、不利于高分子链的分散，导致絮凝效果较差[18-20]。发酵液中不仅有大量的代谢产物，还存在胶体、细胞碎片等物质，干扰了无机离子的电中和作用。与其他采收方法相比，三氯化铁采收率相对较高，且采收成本相对较低，适合开展进一步的工艺优化，以进一步提高采收率。

3.2 不同工艺参数对采收率的影响

本研究选择絮凝剂添加量为2 g·L-1。而赵奎等[12]研究表明，絮凝剂用量越大越好，与本研究结果有差异，可能是该研究所用研究对象是自养藻，培养液中成分简单，只有水、少量可溶性无机盐和藻细胞。另外，该研究的试验过程中采收率并没有达到最大值，采收率始终随着絮凝剂的用量而增加。

搅拌是生化反应中的常用操作，目的是为了使溶液中的各种成分能够混合均匀，以防局部反应物浓度过高，从而缩短反应时间，提高反应速率。絮凝剂、发酵液均是可溶性物质，絮凝剂通过桥架、吸附等作用，同时还发生一些物理化学变化，进而胶体等微粒相互碰撞、相吸形成絮状沉淀。但搅拌在提高絮凝剂、发酵液混合均匀度的同时，也会影响絮状沉淀，搅拌速率过大会导致絮凝效果变差。本研究中搅拌速率超过150 r·min-1后，采收率反而有所下降，这可能是由于搅拌速率过高，产生的剪切力过大，这种作用力超过了絮凝剂与细胞之间的桥架、吸附作用力，从而将部分絮凝团打散、采收率下降。本研究相关结果与陈晓燕等[14]的研究结果相同。

絮凝是一个缓慢的过程，不像酸碱中和之类的生化反应那样剧烈，因此，絮凝过程需要一定的时间。搅拌能够让反应体系中各成分混合均匀、充分接触，如果搅拌时间过短，就会导致絮凝不完全，采收率不理想。本研究发现，当搅拌时间达到20 min时，采收率达到94.6%，继续延长搅拌时间，采收率反而有所降低。这说明，在合适的剪切力范围内，随着絮凝的完成，絮凝团内部结构稳定。陈晓燕等[14]研究表明，使用阳离子淀粉絮凝剂收获自养斜生栅藻，搅拌10 min即可达到最高采收率，继续搅拌将浪费能源。本研究所用搅拌时间较长的原因是生物量高、发酵液成分极其复杂。

由于发酵液成分复杂、杂质过多，有机絮凝剂、霉菌吸附均对异养小球藻絮凝效果不太理想，无机絮凝剂三氯化铁显示了较好的絮凝效果。通过单因素试验、响应面分析，获得了最优变量为絮凝剂添加量2.0 g·L-1、搅拌速率150 r·min-1、搅拌时间20 min，在此条件下进行试验验证可得采收率达到95.3%，回归分析和验证试验均表明响应面分析结果合理、可信。

本研究获得的最佳工艺条件下采收率仍然比自养藻的絮凝法低，自养藻的生长仅需要光照、二氧化碳，自养藻工业化培养过程为了提高培养效率往往在培养液中加入少量无机盐，张正洁等[21]在培养自养藻时仅加入0.02 g·L-1的碳酸钠，异养藻在培养过程中使用大量的营养成分，从生物量角度分析，自养藻生物量受到光照、营养物质限制，一般生物量仅2 g·L-1，而异养藻则高达140 g·L-1。因此，整体而言，自养藻培养液生物量、营养盐浓度都远远低于异养藻，培养液成分复杂导致异养藻絮凝过程受到干扰，采收率低于自养藻。这也是絮凝法在异养小球藻实际生产中应用相对较少的原因之一。与前人研究结果相比，本研究的絮凝剂用量偏高，可能是藻液特性的影响，也可能是试验手段较为单一。本研究将在后续试验中借鉴其他试验手段对试验方法进一步优化[22]。传统细胞采收使用的絮凝法采收率往往接近于100%[23]，而本研究所获得的结果相对较低，这也说明单一絮凝剂使用效果有一定的局限性。彭超等[24]的研究表明，选择合适的复合絮凝剂将产生明显的协同作用，使采收率远高于单一絮凝剂，絮凝效果更好；任翱等[25]使用絮凝法与加压相结合进行絮凝采收，也取得了较好的试验结果。因此，本研究将在后续试验中开展进一步的研究。