间充质干细胞凝胶对大鼠四期压疮创面愈合的作用及机制

王旌臻，胡芳 ，张杰，白晓温

1天津医科大学总医院普外科，天津 300052；2天津医科大学总医院护理部，天津 300052

压疮（PU）是由于压力和（或）摩擦力等其他外力长期作用下导致的皮肤局限性损伤。老年患者常因合并基础病、组织修复能力弱等原因易形成难愈性疮面，其中重度PU不仅为老年人身心带来痛苦，更严重者可致全身感染，危及生命[1]。目前创面治疗主要以湿性愈合理念为主，并通过手术、负压吸引等方式促进修复[2]。近年来间充质干细胞（MSCs）为损伤治疗提供了新方法，它具有多向分化潜能，可促进生长因子的释放及血管化[3]。但人胎盘MSCs凝胶在不同愈合环境中的作用效果是否存在差异，有待进一步研究。2019年10月—2020年10月，本研究以缺血再灌注损伤制备大鼠四期PU模型，比较不同愈合环境下的创面愈合率，血清炎性因子水平，为MSCs凝胶在PU中的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 126只雄性清洁级SD大鼠（中国大兴食品药品检定研究院）。根据文献报道大鼠皮肤厚度在幼年及老年时期均较中年时期薄，幼年与老年大鼠皮肤厚度相近，且幼年大鼠更便于造模仪器的固定、有利于实验模型的成功建立，故选择鼠龄为4～6周。质量（170±5）g，许可证号 SCXK（京）2017-0005，实验动物伦理批件号IRB2020-DW-06。大鼠造模前分笼适应性饲养1周，造模及治疗期间不限制饮食，可自由活动，明暗周期12 h。

1.2 试剂 人胎盘MSCs凝胶（北京汉氏联合生物技术股份有限公司）；水胶体敷料、清创胶（康乐保医疗有限公司）；大鼠IL-10 ELISA试剂盒（深圳达科为生物科技有限公司）；大鼠TNF-α和VEGF ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）。

1.3 造模方法 大鼠编号后，按照随机数字表法选取6只作为正常组。其余120只大鼠进行PU造模[4]：①10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，大鼠背部皮肤备皮4 cm×6 cm，按照标记序号依次以两块圆形磁铁（直径12 mm，厚度5 mm，磁通量4 000 G）将大鼠背部皮肤对称夹起，皮肤被压厚度（5±2）mm，中间空余折叠皮肤长度约1 cm。磁铁压迫3 h后，放松0.5 h，以此为一个循环，两次循环后继续压迫过夜约16 h至次日晨。②次日晨磁铁放松1 h后，其余造模方法同前日。③经两日压迫后，大鼠背部磁铁再次放松1 h，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉，75%酒精消毒受压背部皮肤，使用高温灭菌后的皮肤打孔器做8 mm圆形创伤。PU成模标准[5]：全层皮肤和组织的缺失，创面伴有可见或可触及的筋膜、肌肉、肌腱、软骨或骨外露，伤口床可见腐肉和（或）焦痂及伤口炎性渗液或渗血。本造模方法简单可行，造模过程中无大鼠死亡。

1.4 分组及干预方法 将120只PU模型大鼠随机分为对照组、干性-临床组（GL组）、湿性-临床组（SL组）、干性-干细胞组（GG组）及湿性-干细胞组（SG组），每组24只。对照组无治疗措施，自然愈合；GL组予以涂抹碘伏+纱布包扎；SL组予以涂抹清创胶+水胶体覆盖；GG组予以涂抹MSCs凝胶+纱布包扎；SG组予以涂抹MSCs凝胶+水胶体覆盖。治疗15 d，治疗期间每隔3天采用生理盐水清创后，重新换药包扎。

1.5 评价指标

1.5.1 创面愈合率 治疗第3、6、9、15天时，各组随机选取6只大鼠测量创面面积，以创面完全上皮化作为愈合判定标准，使用Image-pro Plus6.0图像分析软件进行计算，创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%。

1.5.2 血清炎性因子TNF-α、IL-10及VEGF水平正常组大鼠麻醉后采集腹主动脉血5 mL，其余5组大鼠在治疗第3、6、9、15天时，随机选取6只采集腹主动脉血5 mL。转速3 000 r/min离心15 min后取血清，采用ELISA法测定炎性因子TNF-α、IL-10及VEGF水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个均数间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时点创面愈合率比较 治疗3 d时，GG组、SG组创面愈合率均高于对照组，GG组创面愈合率高于SG组（P均＜0.05）。治疗6 d时，SL组、GG组、SG组创面愈合率均高于对照组（P均＜0.05），GG组创面愈合率高于SG组（P均＜0.05）。治疗15 d时，各治疗组中GG组创面愈合率最高、GL组创面愈合率最低，且均高于对照组（P均＜0.05）。治疗6 d、9 d、15 d时，SL组创面愈合率均高于GL组（P均＜0.05），GG组创面愈合率均高于SG组（P均＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠不同时点创面愈合率比较（%，±s）

表1 各组大鼠不同时点创面愈合率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与SL组比较，△P＜0.05；与GG组比较，#P＜0.01。

组别观察时间n 6 6 6 6 6 3 d 9.14±1.24 10.37±0.88△7.74±0.93 18.82±1.20*△12.28±1.03*△#72.60＜0.01 15 d 78.43±3.62 84.13±1.48*△88.23±2.11*97.81±1.19*△92.43±3.14*△#44.80＜0.01对照组GL组SL组GG组SG组F值P值6 d 11.85±1.19 12.63±0.78△16.68±1.47*32.86±3.20*△21.65±2.55*△#88.41＜0.01 9 d 23.89±0.88 28.62±1.69*△35.47±3.19*62.68±4.27*△42.07±4.46*△#110.31＜0.01

2.2 各组血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比较

2.2.1 血清TNF-α水平 治疗3 d时，对照组血清TNF-α水平高于正常组（P＜0.01），各组均在3 d时达高峰。治疗9 d、15 d时，SL组血清TNF-α水平均低于GL组，GG组血清TNF-α水平均低于SG组（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时点血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比较（ng/mL，±s）

表2 各组大鼠不同时点血清TNF-α、IL-10及VEGF水平比较（ng/mL，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与SL组比较，△P＜0.05；与GG组比较，#P＜0.05；与对照组比较，aP＜0.05；与SG组比较，bP＜0.05。

TNF-α 327.34±28.71 IL-10 132.26±15.26组别正常组对照组3 d 6 d 9 d 15 d GL组3 d 6 d 9 d 15 d SL组3 d 6 d 9 d 15 d GG组3 d 6 d 9 d 15 d SG组3 d 6 d 9 d 15 d VEGF 11.34±0.76 728.79±39.79*665.05±48.15 568.94±38.85 512.25±32.61*198.15±20.37*#173.84±23.07#156.44±8.56#130.76±13.72#15.27±1.43*△17.89±1.39△16.29±1.10△12.09±1.06△681.05±34.95*636.47±41.84 530.26±36.48△462.14±36.78*△229.50±13.59*△#201.70±11.23△#177.36±8.26△#135.30±13.15#17.57±1.25*a 20.57±1.06a 19.15±0.80a 13.85±0.98*a 630.69±32.19*567.81±34.34 455.98±32.18 420.06±28.28*256.39±11.91*#228.14±17.35#197.74±12.19#139.74±12.02#22.00±0.46*b 23.03±0.66b 22.03±1.22b 15.39±0.71*b 580.06±42.39*a 529.95±35.58a 399.29±30.88a 363.12±28.71a 364.38±15.61*308.89±19.40 255.42±13.41 180.62±10.76*24.97±2.71*a 28.80±2.96a 32.60±2.75a 18.31±0.58*a 19.93±0.63*a#25.75±0.87a#26.80±1.45a#16.63±0.43*a#656.64±33.21*#a 587.50±30.17#a 460.72±29.32#a 395.22±33.76*#a 303.90±17.84*△#a 258.98±18.87△#a 230.50±24.48△#a 161.98±10.83*△#a

2.2.2 血清IL-10水平比较 治疗3 d时，对照组血清IL-10水平高于正常组（P＜0.01）。各组均在3 d时达高峰。治疗3 d、6 d、9 d、15 d时，GG组血清IL-10水平均高于其余各组，SG组血清IL-10水平均高于SL组（P均＜0.05）。治疗3 d、6 d、9 d时，SL组血清IL-10水平均高于GL组（P均＜0.05）。治疗15 d时，GG组与SG组血清IL-10水平均高于正常组（P均＜0.01）。见表2。

2.2.3 血清VEGF水平比较 治疗3 d时对照组血清VEGF水平高于正常组（P均＜0.01）。各治疗组各时点血清VEGF水平均高于对照组（P＜0.05）。治疗3 d时，SL组血清VEGF水平高于SG组（P＜0.05）。治疗3 d、6 d、9 d、15 d时，GG组血清VEGF水平均高于SG组（P均＜0.05）。GL组和SL组血清VEGF水平于6 d时达高峰，GG组和SG组血清VEGF水平于9 d时达高峰。见表2。

3 讨论

3.1 炎性因子在损伤愈合中的变化趋势 四期PU发生于全层皮肤，是伴有可见的筋膜、肌肉或骨外露的重度损伤[6]。创面的愈合常包含三个时期，即炎症反应、肉芽组织形成和创面修复重建。各种细胞因子的调控在创面愈合中具有重要作用。适度的炎症反应可清除坏死组织，维护组织的正常愈合，但在慢性创面中，炎性因子的过度释放引发瀑布式级联反应。

TNF-α是由巨噬细胞和T细胞产生的促炎性细胞因子[7]，可损伤血管内皮细胞，也可诱导IL-10表达。IL-10是抗炎性细胞因子，可促进巨噬细胞合成和释放抗炎因子，同时也能抑制TNF-α受体表达。机体炎症的反应程度在一定程度上可通过抗炎因子与促炎因子的相互作用体现。本研究发现，治疗3 d时对照组血清TNF-α、IL-10水平均高于正常组，且各组均在3 d时达高峰，表明PU愈合初期炎症反应最为明显，巨噬细胞等免疫细胞参与炎症反应，PU愈合后期主要表现为组织修复，故随着各组创面逐渐愈合，炎症反应逐渐减弱，炎性因子表达随之降低。

VEGF可调控血管内皮细胞的增殖与迁移。缺血缺氧的创面刺激VEGF表达增多，促进血管内皮细胞增殖及微小血管的新生，满足损伤的血液供应[8]。本研究发现，治疗3 d时对照组血清VEGF水平高于正常组，且VEGF水平于6 d时达高峰，提示对照组血清VEGF水平较正常组表达呈应激性增多，之后下降，逐渐向正常皮肤组织表达水平回落。考虑随着PU创面缺血缺氧状态逐渐改善，大量成纤维细胞增殖，新生血管减少，继而VEGF水平呈下降趋势。

3.2 湿性密闭愈合环境有利于压疮创面愈合 PU难以愈合受多种原因影响，例如炎症介质血供不足。以往PU的治疗常采用纱布等干性敷料，干性环境易使伤口干燥，阻碍表皮细胞迁移。越来越多的研究表明，保持创面湿性愈合环境更有利于愈合[9-10]。密闭湿润环境可预防外部细菌感染，保持多种酶和酶的活化因子的活性，促进纤维蛋白及坏死组织的溶解，加速细胞的增殖和分化。治疗6 d、9 d、15 d时，SL组创面愈合率均高于GL组，表明湿性愈合环境下更易提升创面愈合速度，本研究同样证实湿性密闭的愈合环境有利于成纤维细胞合成及肉芽组织形成，促进上皮细胞的增殖，缩短愈合时间。

3.3 MSCs凝胶能够促进压疮创面愈合且在干性愈合环境中的作用更优 MSCs在骨髓、脂肪、脐血及胎盘等组织中广泛存在，胎盘MSCs、取材方便、无伦理学争议，是一种可靠的细胞来源[11]。水凝胶是由亲水性聚合物、共聚体或单体大分子组成的高分子材料，可搭载细胞、小分子药物用于治疗。目前已有研究将MSCs凝胶应用于子宫内膜损伤[12]、结肠炎[13]等治疗，均表现出较好的作用效果。本研究发现，各时段GG组和SG组的创面愈合率均高于对照组，且高于SL组，提示应用MSCs凝胶能有效提高创面的愈合速度；MSCs的免疫调节功能可抑制炎症，改善创面的微环境[14]。本研究发现，与对照组相比，GG组和SG组血清TNF-α水平降低，血清IL-10和VEGF水平升高，提示MSCs凝胶可显著上调VEGF、IL-10的表达水平，下调TNF-α表达，减轻创面的炎症反应程度，促进血管发生及增强血管的稳定性。

虽然MSCs凝胶具有吸水与供水能力，在创面组织可发生反复水合作用，但MSCs凝胶是否适用于湿性愈合环境尚不清楚，本研究发现，GG组多个时点的创面愈合率高于SG组，表明MSCs凝胶在干性环境的作用效果优于湿性环境。这可能是因为MSCs移植治疗中存活率存在问题，其很有可能在未发挥生物学功能前已被不利的微环境所阻碍[15]。由于4期PU伤口渗液常常大量渗出，超过敷料及自身组织的承受能力，湿性密闭环境下易引发伤口浸润[16]。同时渗液中的炎性介质影响干细胞的作用微环境及活性，影响其修复能力，导致伤口愈合减缓。

综上所述，在四期PU的治疗中，MSCs凝胶在干性愈合环境中可提高PU创面愈合率，优于湿性愈合环境，其机制可能为减轻创面炎症反应、促进血管新生。但在MSCs的应用过程中是否存在作用于其他细胞因子或信号通路，有待更多样本量的深入研究。