拳卷地钱乙醇提取物HPLC 指纹图谱与其抗急性肝损伤的谱效关系

李平凤，黎 理，谢凤凤，李 鹏，刘婧曦，赵 凌，龚登美，朱 华

（广西中医药大学，广西南宁 530001）

地钱又称地衣，喜生于阴湿之地，广泛分布于全国各地，其药用始载于《名医别录》，其味淡，性凉，归肝经，具有清热利湿、解毒敛疮之功效，主治湿热黄疸、疮痈肿毒、毒蛇咬伤、水火烫伤、骨折、刀伤等［1］。广西境内有地钱 Marchantia polymorpha L.、粗裂地钱 Marchantia paleacea Bert.、拳卷地钱Marchantia convoluta Gao et Chang3种地钱属植物，以拳卷地钱为主，为广西民间常用中草药［2］，常用其外治烫伤骨折、体癣、溃疡不愈合，内治黄疸型肝炎，均取得良好效果［3］。

中药化学成分复杂多样，不同成分协同发挥药效作用。在研究谱效关系时，需要将能展现中药“有效组分群”的指纹图谱与功效相结合来反映其中化学成分与药效的内在联系，才能建立起中药与药效基本一致的、能全面反映产品内在质量的质量标准［4-6］，但尚无拳卷地钱在该方面的报道。因此，本实验建立了11 个产地的拳卷地钱乙醇提取物的HPLC 指纹图谱，通过灰色关联分析、多元线性回归分析与其四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤保护作用的谱效关系，以期为该药材用于衡量抗急性肝损伤保护作用的程度提供条件，对评价其内部质量具有重要意义。

1 材料

1.1 试剂与药物 从广西采集11 批拳卷地钱（编号A1～A11），经广西中医药大学韦松基教授鉴定为拳卷地钱Marchantia convoluta Gao et Chang，具体信息见表1。芹菜素对照品（20 mg，纯度99.2%，中国食品药品检定研究院，批号111901-201603）。吐温-80 购自天津富宇精细化学试剂有限公司；CCl4、水合氯醛均购于国药集团化学试剂有限公司；联苯双酯滴丸（1.5 mg × 250 丸／瓶，批号A02150123，日用量22.5～45 mg）购于万邦德制药集团股份有限公司；ALT／GPT 试剂盒（批号180915）、AST 试剂盒（批号180811）均购自南京建生物工程有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）；甲醇、95% 乙醇、无水乙醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；冰乙酸为色谱纯（天津大茂化学试剂厂）。

表1 样品信息

1.2 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置G-1311C四元泵、二极管阵列检测器、Agilent 1260 series 色谱工作站（美国安捷伦科技公司）；KQ-5200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-A6 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；TGL-16G 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Millipore Direct-Q3，5，8 纯水／超纯水一体机（德国默克公司）；5810R 低温冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；动物电子天平（美国双杰公司）。

1.3 动物 SPF 级健康SD 大鼠，雄性，体质量（200±20）g，由湖南斯柯达生物科技股份有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002，实验动物质量合格证号43004700050126，于通风、清洁、安静、温湿度适宜的环境中适应性喂养1 周，其间自由饮水进食。

2 方法与结果

2.1 乙醇提取物制备 取11 批前期处理好的药材。按照文献［7］报道的方法进行提取。250 g 样品用80%乙醇回流提取3 次，每次0.5 h，料液比为1 ∶15，过滤合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，蒸至约400 mL 后转入蒸发皿，蒸至浸膏状，即得。再采用萃取硅胶柱层析法纯化提取物，干法装柱，将浸膏状提取物与硅胶按1 ∶1 比例拌样，70%甲醇洗脱，减压蒸馏回收甲醇，药液浓缩至浸膏状进行冷冻干燥，得到冻干粉，编号与表1 一致。

2.2 HPLC 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件 InertSustainC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～30 min，5%～28% A；30～78 min，28%～80% A；78～88 min，80%A；88～100 min，20%～100%A）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；检测波长270 nm；进样量10 μL。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称定“2.1”项下冻干粉（A10）0.2 g，置于50 mL 锥形瓶中，25 mL 甲醇超声（100 Hz、30 Hz）提取5 min，溶解后冷却静置至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 3 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的芹菜素对照品0.58 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，即得（0.023 2 mg／mL）。

2.2.4 图谱生成 将对照品、供试品溶液按在2.2.1”项色谱条件下进样测定，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版）”，将供试品溶液中的色谱峰数据以中位数法生成对照指纹图谱，得到11 个共有峰，见图1～3。

图1 11 批样品HPLC 指纹图谱

图2 共有峰HPLC 色谱图

图3 芹菜素对照指纹图谱

2.3 抗急性肝损伤研究

2.3.1 分组 140 只大鼠随机分成14 组，每组10 只，分别为空白组（正常大鼠灌胃给予1 mL／100 g 蒸馏水，每天1 次，连续10 d）、模型组（造模大鼠灌胃给予1 mL／100 g蒸馏水，每天1 次，连续10 d）、阳性药组（造模大鼠灌胃给予3 mg／kg 联苯双酯滴丸混悬液［8-9］，每天1 次，连续10 d）、乙醇提取物组A1～A11（造模大鼠灌胃给予100 mg／kg乙醇提取物混悬液［10］，每天1 次，连续10 d）。

2.3.2 模型建立 各组大鼠连续灌胃给药10 d，于第10天给药后2 h 开始造模，当天大鼠禁食不禁水。除空白组外，其余各组大鼠均腹腔注射含10%四氯化碳的花生油液，剂量5 mL／kg［10］，建立急性肝损伤模型。

2.3.3 指标检测 大鼠末次灌胃给药后禁食，24 h 后采集指标，称定体质量，腹腔注射10% 水合氯醛溶液麻醉后，腹主动脉取血，4 ℃下5 000 r／min 离心15 min，取血清，-80 ℃下冷冻保存。采用ELISA 法，检测ALT、AST水平［11］。

2.3.4 结果分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，组间比较采用两样本均数t 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义，结果见表2。由此可知，与空白组比较，模型组AST、ALT 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组AST、ALT 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 谱效关系研究

2.4.1 灰色关联度分析 灰色关联分析法是衡量因素间关联程度的分析方法，亦称“灰色关联度”，来自于20 世纪80 年代邓聚龙教授提出并创立的一门新兴学科——灰色系统理论［12］，近年来该方法在中药谱效关系研究中的应用较为广泛。

表2 乙醇提取物对血清ALT、AST 水平的影响（，n＝10）

表2 乙醇提取物对血清ALT、AST 水平的影响（，n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

本实验将指纹图谱共有峰的相对峰面积作为子序列（表3），抗急性肝损伤的药效指标（AST、ALT）作为母序列（表4），采用均值法分别对参考序列、比较序列进行无量纲化处理，计算灰色关联系数、关联序，结果见表5。由此可知，各共有峰与AST、ALT 的相关系数均大于0.749，即与药效具有较密切的相关性，其中5、1 号峰关联度较高（＞0.9），表明乙醇提取物抗急性肝损伤的作用是通过其内部“有效组分群”的协同作用所致，贡献值依次为5 号峰（芹菜素）＞1 号峰＞9 号峰＞6 号峰＞7 号峰＞2号峰＞11 号峰＞4 号峰＞9 号峰＞8 号峰＞3 号峰。

表3 各共有峰相对峰面积

表4 11 批样品血清ALT、AST 水平降低率

表5 各共有峰与AST、ALT 水平降低率的关联度

2.4.2 多元线性回归分析 选择各共有峰相对峰面积的量化特征峰数据作为自变量（X），成分峰依次设为X1、 X2、……、 X11，给药组AST、ALT 水平降低率分别作为Y1、Y2，采用SPSS 21.0 软件，通过后退法建立多元线性回归方程。结果，X1、 X8与抗AST 呈正相关，而X2与抗AST效应呈负相关，谱效关系方程为Y1＝0.289+0.008X1-0.015X2+0.008X8（P ＜0.01，R2＝0.960）；X5、 X8与抗ALT 效应呈正相关，谱效关系方程为Y2＝0.245+0.015X5-0.034X8（P＜0.01，R2＝0.929），表明方程中各自变量均有显著相关性。

3 讨论

灰色关联度分析作为一种对模糊系统研究的有效手段，目前在各个行业领域中得到了广泛应用［13］，将其应用于中药材质量差异评价也是一种趋势，它能描述系统发展过程中各因素之间的相对变化，适用于解决中药多成分、多类别、多指标的复杂体系的问题，而多元线性回归分析是研究1 个因变量（Y）与1 个或多个自变量（X）之间是否存在线性关系的方法［14］。由于相关分析方法中包括灰色关联度分析，而多元线性回归分析是其中1 个分支，是将变量相关关系转变为函数关系并建立表达式，用于研究变量间数量变动关系的分析方法，故灰色关联分析是多元线性回归分析的基础，两者既相互区别，又相辅相成。因此，本实验采用灰色关联分析和多元线性回归分析研究拳卷地钱乙醇提取物HPLC 指纹图谱与其对四氯化碳诱导大鼠急性肝损的保护作用的谱效关系，以期探索指纹图谱和药效之间的相关性。

结果，各色谱峰与药效的相关系数均大于0.7，指纹图谱所建立的特征峰与拳卷地钱乙醇提取物抗急性肝损伤药效均呈正相关，表明芹菜素及其他未确定结构的化合物是其活性的基础物质，与其药效有较大关联。根据关联度大小，确定11 个特征峰对抗急性肝损伤作用贡献的依次序为5 号峰（芹菜素）＞1 号峰＞9 号峰＞6 号峰＞7 号峰＞2 号峰＞11 号峰＞4 号峰＞9 号峰＞8 号峰＞3 号峰，关联度越大，活性越强。

多元线性回归后退法是在灰色关联分析结果的基础上，通过SPSS 21.0 软件将拳卷地钱乙醇提取物HPLC 指纹图谱峰信息与抗急性肝损伤药效相结合，建立谱效关系方程，以进一步了解各共有峰与抗急性肝损伤药效的关系，同时验证灰色关联度分析的可行性与可靠性。本实验通过8 批样品的共有峰和药效数据建立拳卷地钱乙醇提取物抗急性肝损伤谱效关系方程，分别为抗AST，Y1＝0.289+0.008X1-0.015X2+0.008X8（P＜0.01，R2＝0.960），X1＞X2＞X8；抗ALT，Y2＝0.245+0.015X5-0.034X8（P ＜0.01，R2＝0.929），X5＞X8，与灰色关联度分析结果基本一致，而且该方程合理有效，可用于抗急性肝损伤药效的预测，并对各共有特征峰所代表化学成分与抗急性肝损伤药效的关系有更深入的了解，在一定程度上解决了成分与药效断层的问题，对该药材全面的质量分析具有重要的理论意义和实践价值。