UPLC-MS／MS 法同时测定抗萎平异合剂中7 种成分

李玲慧，李 丹，黄汉明，许 文，徐 伟

（1.福州市中医院，福建福州 350001；2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

抗萎平异合剂是福建省福州市中医院用于治疗脾胃气虚、气滞血瘀、热毒内蕴所致慢性萎缩性胃炎的院内制剂，由黄芪、党参、木蝴蝶、蒲公英等十余味中药组成［1］，具有健脾和胃、理气活血的功效，临床疗效显著，对于改善症状，减轻或逆转胃黏膜腺体萎缩、肠化、异型增生及清除HP 均有一定作用［2］。但目前关于抗萎平异合剂的质量控制标准相对薄弱，尤其是缺少含量测定指标，故本实验在前期研究的基础上对其进行深入考察。

对于复方质量标准，北京中医药大学张世臣教授提出基于全程质量控制理念的工业饮片标准化体系建设研究［3］；中国中医科学院刘安课题组提出以质量为核心的优质中成药评价标准研究［4］；天津中医药大学刘昌孝院士针对中药药效物质与中医药基本属性的基础研究薄弱，致使质量控制指标与中药传统功效的关联性不强、质量控制指标的专属性差等共性问题，提出发展中药质量标志物（Qmarker）理论方法和策略，以期提升中药科学技术水平［5］。

近年来，UPLC-MS／MS 被越来越多地应用于中药或复方分析，它具有更高的分离度和灵敏度，有利于多指标成分含量测定，为其合理化质控指标的选择提供了定性和定量手段［6-8］；另一方面，建立快速定量分析方法（如UPLC 等）可大大节省时间和溶剂，为中药复方质量标准的提升提供了新技术［9-11］。因此，本实验通过UPLC-MS／MS 法同时测定抗萎平异合剂中咖啡酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、党参炔苷、黄芪甲苷、甘草酸的含量，再结合现代中药质控理论选择木蝴蝶苷B 作为Q-marker［12］，通过UPLC-DAD 法对其含量进行测定，以期为该方质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱仪、Xevo TQS 三重四级杆质谱、Waters ACQUITY UPLC H-Class（美国 Waters 公司）；CPA225D 型电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）；KQ-500DE 型台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 咖啡酸（批号 110885-201703）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606）、甘草苷（批号111610-201607）、木蝴蝶苷B（批号111915-201603）、党参炔苷（批号111732-201607）、黄芪甲苷（批号 110781-200613）、甘草酸（批号110731-201720）对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%。抗萎平异合剂由福州市中医院提供，批号180314、180321、180328。乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取咖啡酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、党参炔苷、黄芪甲苷、甘草酸对照品适量，50%甲醇制备成1 038、1 020、1 162、1 170、904、1011、984 μg／mL 贮备液，精密量取适量，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（各成分质量浓度分别为25.95、25.5、58.1、585、22.6、50.55、246 μg／mL）。另精密称取木蝴蝶苷B 对照品10.60 mg，置入50 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制成每l mL 含212 μg该成分的贮备液，进一步稀释成21.20 μg／mL，摇匀，供UPLC 检测用。

2.1.2 供试品溶液 精密量取合剂1 mL，置于100 mL 量瓶中，加50%甲醇适量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液制备 按照处方比例和工艺，制备不含木蝴蝶的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备，即得。

2.2 各成分含量测定（UPLC-MS／MS 法）

每次来送货卡车时，登子一早守候在营业部大门边，小阿布硬是跟着来了。甲洛洛每次把小阿布带在身边，给他一些自己收藏给儿子们的糖果，有时也带回家里，把剩菜剩饭热一下，让小阿布吃个饱。慢慢的，登子不到营业部卸货，小阿布也守在营业部大门边，只要看到甲洛洛出来，便欢叫着扑进甲洛洛怀里：爷爷，我肚子饿！

2.2.1 UPLC 条件 Waters CORTECS C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10% A；0.5～4.0 min，10%～30% A；4.0～6.0 min，30%～60%A；6.0～7.0 min，60%～80%A；7.0～7.1 min，80%～10% A；7.1～10 min，10%A）；体积流量0.25 mL／min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.2.2 MS 条件 正离子多反应监测（MRM）模式；毛细管电压3.50 kV；脱溶剂气氮气，体积流量800 L／h，温度500 ℃；锥孔气氮气，体积流量150 L／h；离子源温度150 ℃；二级锥孔萃取电压3.00 V；碰撞气氩气。其他参数见表1，色谱图见图1。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液20、50、100、200、400、1 000 μL，置于10 mL 量瓶中，50% 甲醇定容后摇匀，在“2.2.1”“2.2.2”项条件下测定。以峰面积（Y）对各成分质量浓度（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

图1 各成分UPLC-MS／MS 色谱图Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.2.3.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”项条件下测定，测得各成分日内精密度RSD 分别为咖啡酸4.4%、毛蕊异黄酮葡萄糖苷3.5%、甘草苷3.2%、木蝴蝶苷B 1.3%、党参炔苷4.4%、黄芪甲苷2.7%、甘草酸2.5%；日间精密度RSD 分别为咖啡酸4.0%、毛蕊异黄酮葡萄糖苷4.1%、甘草苷2.2%、木蝴蝶苷B 1.4%、党参炔苷4.2%、黄芪甲苷2.2%、甘草酸1.4%，表明仪器精密度良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.3.3 稳定性试验 取合剂（批号180314）1 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”“2.2.2”项条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为咖啡酸3.4%、毛蕊异黄酮葡萄糖苷4.2%、甘草苷2.3%、木蝴蝶苷B 1.1%、党参炔苷4.1%、黄芪甲苷2.8%、甘草酸1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.3.5 加样回收率试验 精密量取合剂（批号180314）6 份，每份0.5 mL，按1 ∶1 比例分别加入对照品溶液，其中咖啡酸（1 038 μg／mL）25 μL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（1 020 μg／mL）30 μL、甘草苷（1 162 μg／mL）100 μL、木蝴蝶苷B（1 170 μg／mL）800 μL、党参炔苷（904 μg／mL）15 μL、黄芪甲苷（1 011 μg／mL）45 μL、甘草酸（984 μg／mL）50 μL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，咖啡酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、党参炔苷、黄芪甲苷、甘草酸平均加样回收率分别为97.53%、104.30%、98.45%、98.08%、99.31%、102.31%、97.77%，RSD 分别为4.2%、3.6%、4.0%、4.3%、3.3%、3.3%、3.8%。

2.2.4 样品含量测定 取合剂（批号180314）1 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”项条件下测定，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.3 木蝴蝶苷B 含量测定（UPLC-DAD 法）

2.3.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10%A；0.5～10 min，10%～18% A；10～15 min，18%～25%A；15～15.1 min，25%～10%A；15.1～20 min，10% A）；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；检测波长276 nm；进样量5 μL，色谱图见图2。由此可知，木蝴蝶苷B 与其他色谱峰分离度良好，理论塔板数按该成分计不低于5 000。

图2 木蝴蝶苷B UPLC-DAD 色谱图Fig.2 UPLC-DAD chromatograms of baicalein-7-O-gentiobioside

2.3.2 线性关系考察 取“2.1.1”项下贮备液，制成含 1.060、2.120、4.240、8.480、16.96、33.92 mg／L 木蝴蝶苷 B 的对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以木蝴蝶苷B质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝35.20X-2.528（r＝0.999 8），在1.060～33.92 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 重复性试验 取合剂（批号180314）6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得木蝴蝶苷B含量RSD 为1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 精密度试验 在同一个实验室内3 个分析人员用同一台仪器，按“2.3.3”项下方法测定，测得木蝴蝶苷B 含量RSD 为1.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取合剂（批号180314）1 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得木蝴蝶苷B 峰面积RSD 为1.9%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率实验 精密量取9 份合剂（180314），每份0.5 mL，分为3 组，每组3 份，分别加入木蝴蝶苷B（212.0 μg／mL）对照品溶液2.3、4.2、6.4 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 木蝴蝶苷B 加样回收率试验结果（n＝3）Tab.4 Results of recovery tests for baicalein-7-O-gentiobioside（n＝3）

2.4 样品含量测定 取3 批合剂，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表5。

表5 木蝴蝶苷B 含量测定结果（n＝3）Tab.5 Results of content determination of baicalein-7-Ogentiobioside（n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选 本实验以现代中药质控理论和2020 年版《中国药典》 一部为指导，根据其中各味中药饮片含量测定的指标成分进行筛选。根据含量测定结果结合Q-marker 理论，发现抗萎平异合剂中木蝴蝶苷B 含量最高，而且现代药理研究表明它具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性［13-15］，能通过抗胃炎、抑制幽门螺旋杆菌、抗胃炎氧化应激等途径调和脾胃［16］，是评价木蝴蝶质量的重要Q-marker［17-19］，也可能是复方功效的重要物质基础之一，故选择其作为指标成分。

3.2 检测波长筛选 本实验采用DAD 检测器在190～400 nm 波长范围内的紫外吸收光谱进行全波长扫描，发现木蝴蝶苷B 最大吸收波长为276 nm，故选择其作为检测波长。

3.3 流动相筛选 参考文献［20］报道，本实验考察了甲醇-水、甲醇-水（含0.1% 甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1% 甲酸），发现乙腈-水（含0.1%甲酸）洗脱时木蝴蝶苷B 分离效果明显更优，出峰时间适宜，峰形较好，基线稳定，能达到系统适用性的要求，故选择其作为流动相。

3.4 耐用性考察 本实验考察了Agilent1290、Waters ACQUITY UPLC H-Class、Waters ACQUITY UPLC I-Class 高效液相色谱仪，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Thermo syncronis aQ C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Ultimate UHPLC XB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱，流动相0.05%甲酸、0.10%甲酸、0.15%甲酸，体积流量0.25、0.30、0.35 mL／min，柱温25、30、35 ℃，发现不同条件下木蝴蝶苷B 含量RSD 均小于2%，表明该方法耐用性良好。

4 结论

本实验首先通过UPLC-MS／MS 法同时测定抗萎平异合剂中咖啡酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、党参炔苷、黄芪甲苷、甘草酸的含量，在此基础上结合含量测定结果与活性分析，筛选出木蝴蝶苷B 作为指标成分，建立UPLC-DAD法测定其含量，可为该方质量控制提供参考。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。