HPLC 法同时测定藿香清胃片、藿香清胃胶囊、藿香清胃颗粒中4 种成分

何 艳，汪 毅，李 敏，王 惠

（1.湘南学院药学院，湖南郴州 423000；2.贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025）

藿香清胃片、藿香清胃胶囊、藿香清胃颗粒由广藿香、栀子、防风、南山楂、六神曲、石膏、甘草加工而成，具有清热化湿、醒脾消滞之功效，临床上用于治疗消化不良、脘腹胀满等症。方中广藿香芳香化湿、醒脾悦胃；栀子、石膏清泻脾胃积热，共为君药；防风疏脾散湿、调脾养胃，为臣药；南山楂、六神曲消食化滞，为佐药；甘草调和诸药，为使药［1］。目前，对藿香清胃系列制剂的质量控制主要是广藿香、南山楂的TLC 定性鉴别，部分标准中增加了栀子苷含量测定，但质控指标单一、不一致；相关文献也仅限于对单一剂型中某一种或某几种指标成分进行定量测定［2-8］，尚无统一的含量测定方法。因此，本实验在参照中药质量标志物原则的基础上［9］，选择君药栀子主要成分栀子苷［10］、臣药防风主要成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷［11］、使药甘草主要成分甘草酸［12］作为指标成分，采用HPLC 法同时测定四者含量，以期为该系列制剂质量控制标准的建立提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置G1311B 四元泵、G1329B 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D DAD 检测器（美国安捷伦科技公司）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XSE-205 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试剂与药物 栀子苷（批号110749-201617，纯度98.4%）、升麻素苷（批号111522-201511，纯度94.8%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201509，纯度95.8%）、甘草酸铵（批号110731-201720，纯度97.7%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。藿香清胃片、藿香清胃胶囊、藿香清胃颗粒共13 批，具体信息见表1。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Atlantis T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～15% A；10～25 min，15%～19% A；25～30 min，19% A；30～45 min，19%～45% A；45～50 min，45% A；50～51 min，45%～10%A；51～55 min，10%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长240 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品栀子苷14.52 mg、升麻素苷5.31 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷5.21 mg、甘草酸铵13.74 mg（甘草酸质量＝甘草酸铵质量／1.020 7），分别置于4 个25 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到贮备液，分别精密吸取6、1、1、1 mL，置于同一10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（4 种成分质量浓度分别为342.9、20.14、19.96、52.61 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取片剂10 片（除去薄膜衣或糖衣）、胶囊10 粒（内容物）、颗粒10 袋（内容物），研细，3 种剂型分别精密称取0.7、0.5、1 g，置于锥形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，称定质量，超声（300 W、40 kHz）处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按片剂处方工艺，分别制备缺栀子、缺防风、缺甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中4 种成分色谱峰的分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于6 个10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，各精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密量取对照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得栀子苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸峰面积RSD 分别为0.25%、0.75%、0.46%、1.34%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号20191108），于0、6、12、18、24、30 h 在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得栀子苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸峰面积RSD 分别为1.29%、1.54%、1.86%、1.69%，表明供试品溶液在30 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批片剂（批号20191108）、胶囊（批号20200403）、颗粒（批号9J02），按“2.2.2”项下方法各制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得片剂中栀子苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸含量RSD 分别为0.87%、0.95%、0.84%、1.74%，胶囊中分别为0.41%、1.65%、1.70%、2.48%，颗粒中分别为1.02%、2.79%、2.72%、0.85%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批片剂（批号20191108）适量，研细，取约0.35 g，精密称定6 份，按100%水平精密加入对照品溶液（0.612 0 mg／mL 栀子苷4 mL、0.150 9 mg／mL升麻素苷1 mL、0.170 1 mg／mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷1 mL、0.132 5 mg／mL 甘草酸4 mL），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算回收率，结果见表3。

2.9 样品含量测定 取藿香清胃系列制剂，每批精密称取2 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各吸取10 μL 进样测定，计算含量，并折算成每日服用量，结果见表4。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表4 各成分含量测定结果（n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 讨论

3.1 指标成分筛选 本实验前期曾测定藿香清胃片中另一君药广藿香中毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷［13-14］的含量，发现其数值较低，重复性较差，故未纳入本实验中。

3.2 色谱条件筛选 本实验采用DAD 检测器在190～400 nm 波长范围内进行紫外扫描，发现各种成分在240 nm 处均有较大吸收，故选择其作为检测波长。参考文献［7，15-16］报道，本实验考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸，发现乙腈-0.1% 磷酸梯度洗脱时各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称因子为1.04～1.10，色谱峰对称性良好，故选择其作为流动相。

3.3 提取方法筛选 本实验比较了不同提取溶剂（100%、70%、50% 甲醇，95%、70%、50% 乙醇）、提取方法（超声、加热回流）、提取时间（20、30、40、50 min）对各成分提取率的影响，发现70%甲醇超声提取30 min 时供试品溶液基线平稳，干扰杂质少，各成分提取量最高，峰形良好，故选择其作为提取方法。

3.4 含量分析 表1 显示，藿香清胃片、藿香清胃胶囊、藿香清胃颗粒规格参差不齐，仅凭质量分数不能准确反映各剂型之间的质量差异，故本实验以每日服用量为依据。结果发现，不同厂家、剂型中各成分每日服用量差异较大，以栀子苷最显著，高达12 倍。因此，亟需建立藿香清胃系列制剂通用标准，以期确保其临床疗效的稳定性。