PGP基因家族成员的结构和功能1)

李洋 刁健 郝昕 马玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

松树是目前世界上最重要的木材来源物种之一，它在生态、社会和经济等方面的价值也得到了极高程度地认可，其作为典型绿化树种[1]，在人类的生活中扮演着重要的角色[2-3]。自然界中松树的主要威胁之一是来自松材线虫的侵害[4-5]。对松树枯萎病(Bursaphelenchusxylophilus)的防控主要运用下列几种方法[6-8]：杀虫剂的空中喷洒、药物熏蒸、病树的人工清除等。结合实践结果分析可知，合成杀虫剂的使用可能会产生环境污染、人类健康受损以及非目标生物破坏等恶性影响[9]。目前为止，注射植物杀线虫剂(主要是阿维菌素类化合物)的防控方法较为安全[10]，可以使松树免受线虫的感染。

多种化合物(例如内源性物质、药物或其他异源生物等)不能通过被动扩散渗透，他们的生物利用度取决于吸收和外排转运蛋白之间的互相平衡，这些蛋白能够促进生物中的底物在膜上的运动[11-13]，且它们在维持细胞稳态和释放潜在有毒物质的生物过程中，起着重要的作用[11-12]。研究表明，有一种针对农药的防御机制与上述作用相似，即由环境污染物积累所引起的毒性保护过程，它们作用的发生与哺乳动物、昆虫以及植物中的外排转运蛋白有关[14-15]。ABC载体可以有效地将有害内源物质以及各种与生长过程无关的外源物质(包括药物等)从细胞中排出，并且能够在生理学、药理学和毒理学等领域中发挥重要作用。此外，ABC载体可以与药物代谢酶发挥协同作用，从而保护生物体免受有毒化合物的侵害[16]。ABC转运蛋白参与了多药耐药性的发展，其作用特点是通过降低细胞内的药物浓度，从而阻止各种恶性疾病的成功治疗[15，17-21]。涉及多药耐药性作用的主要成员分布在ABCB、ABCC、ABCG及其他亚家族。不同成员的表达之间没有相关性，但它们可以在多药耐药的作用过程中发挥协同作用。本研究中涉及到的蛋白质属于ABCB亚家族。

P糖蛋白(PGP)赋予生物的抗药耐药属性只在一部分基因中表现了出来[12，21-22]。ABC转运蛋白的诱导剂和激活剂分别具有增强外排转运蛋白表达水平和活性的能力[23]，因而潜在有害化合物进入特定靶组织的机会有所降低。目前为止，关于PGP家族的基因成员已得到了广泛研究，如MDR1(编码PGP的基因)中的多个单核苷酸多态性作用[24]。对PGP家族所展开的研究主要是关于以下方面：PGP家族涉及到的不同种类神经退行性疾病，如阿尔茨海默症、帕金森症和癫痫病[25-26]等。这种ABC转运蛋白积极参与了生理和病理过程，本课题组主要关注其外排功能的调节。基于以上研究现状可知，有关松材线虫PGP家族的耐药性研究较为有限，这导致有关植物寄生线虫抗性和代谢过程的研究进展缓慢。因此，本研究运用生物信息学手段，分析了Bx-PGP家族中部分成员的蛋白质结构和功能，旨在为日后线虫农药的开发，以及新型预防技术的拓展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 Bx-pgp基因家族成员进化关系及理化特性测定

为了了解松材线虫PGP家族成员信息，从NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载了相应的氨基酸序列。使用MEGA 5.1软件[27]对氨基酸进行了多序列比对，并在此基础上构建了系统进化树。在构建系统进化树时，相关参数设置如下：邻接法(NJ)采样泊松模型，样本的bootstrap为1 000次迭代。

为了进一步验证各蛋白质成员间的进化关系，使用最大似然法(ML)构建[27]系统进化树。从Pfam数据库(http：//pfam.xfam.org/)[28]中获得了Bx-PGP家族中相关基因的DNA结合结构域序列，随后进行了多序列比对。用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)对蛋白质的理化性质进行预测，包括氨基酸数量、相对分子质量、理论等电点值、脂肪系数、亲水性、分子式、总原子数和不稳定系数[29]。

1.2 蛋白质序列基序分析

通过MEME (http://meme-suite.org/) 方法对蛋白质序列的基序进行分析，基序序列的功能通过Pfam 数据库获得 (http://pfam.xfam.org/)。

1.3 疏水性和跨膜螺旋区域分析

通过ExPASy ProtScale网站(https：//web.expasy.org/protscale/)对蛋白质的疏水性进行分析。利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[30]对蛋白质的跨膜区域进行分析。

1.4 拓扑异构模型预测

使用Protter网站(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)对蛋白质的拓扑异构模型进行预测[31]。

2 结果与分析

2.1 Bx-pgp基因家族的鉴定及其理化性质

从基因组中鉴定了10个Bx-pgp基因成员，并以Bx-pgp1至Bx-pgp10的顺序命名了各基因(表1)。由表1可知，10个相应蛋白质的长度和相对分子质量参数有着显著的不同。氨基酸个数为124～1 417，平均长度为794.9 。相对分子质量为13 388.16～160 462.04，平均为89 135.88。这些蛋白质的理论等电点为5.39～9.21，脂肪系数为93.26～109.36。可见，这些蛋白质的热稳定性发生了显著变化。蛋白质亲水性系数为-0.236～0.276，除了Bx-pgp3，Bx-pgp6，Bx-pgp9，Bx-pgp10以外，其他蛋白质的系数值均为正数，表明上述4种蛋白质为亲水蛋白，其他6种蛋白是疏水蛋白。这些蛋白质都包含C、H、N、O和S 5个原子。原子总数为1 891～22 794个。蛋白质不稳定系数为29.48～42.30，其中Bx-pgp3和Bx-pgp10的指数大于40，表明它们的蛋白质结构不稳定，而其他8种蛋白质的指数均小于40，表明其结构稳定。

表1 Bx-pgp蛋白质理化性质

2.2 系统发育进化树及蛋白质基序

通过构建NJ系统发育进化树(图1A)初步揭示了Bx-PGP部分家族成员的进化关系，并以bootstrap重采样测试作为该结果的可靠性基础。为了进一步揭示NJ模型的可靠性，使用JTT + G + F模型构建了ML系统发育进化树(图1B)。由2种发育进化树的结果综合比较可知，这2种模型下的分析结果具有非常好的一致性。

由表2可见，与预期相同，Bx-PGP家族中的蛋白质，特别是那些具有相似进化关系的蛋白质，均含有相同或相似的蛋白质保守结构域。通过运用MEME方法对序列的详细分析，得到了15个保守的蛋白质序列基序。随后，通过Pfam和InterProScan对蛋白质序列基序进行分析，结果表明，基序1和基序3具有ABC转运蛋白结构域，基序5、6、11具有ABC转运蛋白跨膜螺旋结构域，其他基序序列没有详细的功能注释。

图1 Bx-pgp部分家族成员的系统发育进化树

表2 Bx-PGP蛋白质序列基序分析

根据Pfam网站对各蛋白质序列的结构分析可知，关注的Bx-PGP家族成员中的蛋白质，除Bx-PGP6外，都具有ABC转运蛋白结构域，这表明他们可能都具有一定程度的转运功能。除基序1、4、6、9、10外,各蛋白序列均具有ABC转运蛋白跨膜螺旋区域。但Bx-pgp6不含有任何已被注释的基序序列(图2)。

图2 Bx-PGP蛋白质保守结构域分析

2.3 蛋白质疏水性

蛋白质疏水性分析结果以Bx-PGP1为例对结果进行说明。Bx-PGP1蛋白中的第694位天冬氨酸(D)具有-2.978的低疏水性评分，由此可知它具有很高的亲水性。相反，第230位的异亮氨酸(I)具有3.489的较高疏水性得分，表明其更具有疏水性。表3中列出了该家族中10个氨基酸序列的疏水性分析结果，由该结果可知，该家族中的蛋白质包含多个亲水性和疏水性区域，但是他们的分布和聚集现象并不显著。

表3 Bx-PGP疏水性

2.4 跨膜螺旋区域

使用TMHMM网站预测了Bx-PGP基因家族成员的跨膜螺旋区域。结果以Bx-PGP1为例(图3)。通过分析结果可知，Bx-PGP4蛋白具有最多的跨膜螺旋区域片段，共计16个。相反地，Bx-PGP6蛋白不含跨膜螺旋区域片段。在其余的8个蛋白质序列中，跨膜螺旋区域的长度和片段数各不相同。下面以Bx-PGP1为例，简要描述该蛋白质序列中跨膜螺旋区域的分析结果。在Bx-PGP1蛋白序列中，12个跨膜螺旋区域片段的起止位置分别是64～86、123～145、195～213、217～239、298～320、325～347、726～748、774～796、854～871、875～897、958～980和990～1 012；膜外部分的起止位置分别是87～122、214～216、321～324、749～773、872～874和981～989；相反，膜内部分的起止位置分别是1～63、146～194、240～297、348～725、797～853、898～957和1013～1291。表4列出了其他9个蛋白质序列跨膜螺旋区域片段的详细信息。

图3 Bx-PGP基因家族成员的跨膜区域预测结果

2.5 拓扑异构模型预测

该家族中基因的拓扑预测结果以Bx-PGP为例(图4)。由图4可知，该家族中Bx-PGP3具有最多的N-糖基化位点，共计有8个。相反，Bx-PGP6没有N-糖基化位点。表5中显示了该家族中其他9个蛋白质的拓扑异构分析结果。其中，由于分析模型及算法的差异，跨膜螺旋数量上会出现个别与前文不同的结果。研究表明，N-糖基化位点的存在对于蛋白质的折叠和运输非常重要。因此，该预测结果可以从另一个角度证实笔者的假设，即Bx-PGP家族成员的耐药性与药物流出密切相关。

1～12表示跨膜螺旋的数量。

表4 Bx-PGP基因家族成员的跨膜区域

表5 Bx-pgp蛋白拓扑异构分析结果

3 结论与讨论

松材线虫的隐蔽性特征使得其与寄主间的关系极为复杂[4，32]。正因为有效控制方法的缺乏，使得它们给林业领域带来了不可预估的损失。研究可知，效果显著且成本较低的一种方法是对潜在目标的发现和利用[32-33]。真核生物中的PGP家族成员，可以将外源物质从细胞中去除，例如有效降低细胞中的药物浓度，这在生物体对药物的耐受反应过程中起着极其重要的作用。随着生物耐药性研究进展的不断推进，PGP家族成员在耐药性和新陈代谢等方面的作用也得到了广泛关注[16]。植物寄生性线虫的抗药代谢反应过程是抵抗药物的主要途径，因此，对于松材线虫PGP家族成员功能的研究，将为新型防治技术手段的开发提供理论依据。

本研究对松材线虫PGP基因家族成员进行了多种类型的生物信息学分析。先后运用邻接法(NJ)和最大似然法(ML)构建了Bx-PGP家族成员的系统进化树，从而比较PGP家族中各成员的相似性。通过TMHMM方式对Bx-PGP家族各成员的蛋白序列结构进行预测，结果表明各成员编码的蛋白质，包含了多个跨膜结构域(TMD)和核苷酸结合域(NBD)，因此推测该蛋白家族成员具有物质运输的功能，并具有与其他蛋白及大分子化合物相结合的属性[34]。由于亲水和疏水蛋白的平衡在蛋白质的结构和功能中起着重要作用，因而，本研究通过对蛋白质疏水性分析的探讨，分析了Bx-PGP家族成员的结构特点。蛋白质的转移和定位与其自身结构有着紧密的联系，拓扑异构分析结果可以更直观地了解PGP家族成员，且分析结果更易理解。此外，也可以通过此方法对N-糖基化位点进行预测。N-糖基化位点的存在对蛋白质的折叠和运输起着重要作用，这也可以从另一个角度证实笔者的假设，即Bx-PGP家族成员的耐药性与药物流出有着密切联系。基于对蛋白质疏水性、跨膜螺旋区域和N-糖基化位点等性质的分析可知，特殊结构的存在可以实现药物的胞外转运。因此，可以得出这样一个结论，Bx-PGP基因家族所表现出的耐药性可能与其促进药物外排有关，但是其在多药耐药过程中的功能机制仍需要进一步的试验探索。

截至目前，有关松材线虫PGP家族成员耐药性的报道较少。本研究的结果表明，松材线虫PGP家族成员可能是控制这种寄生线虫破坏植物能力的潜在靶标。然而，与松材线虫抗性相关的其他基因和途径，仍需进一步的探索与发现。本研究的主要目的在于开发一种以Bx-PGP蛋白家族为生物防治靶标的药物协同剂，并为证明其防治效果提供理论依据。