2个生态型三叶青块根主要药用成分动态检测与比较

王盼，康华靖，胡轶娟，徐尉城，周钰鸿，陈子林*

(1.磐安县中药产业发展促进中心，浙江 磐安 322300；2.浙江省大盘山国家级自然保护区管理局，浙江 磐安 322300；3.温州市农业科学研究院，浙江 温州 325006；4.浙江省中医药研究院 药用资源研究中心，浙江 杭州 310007)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，又名三叶崖爬藤、金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，为葡萄科(Vitaceae)崖爬藤属(Tetrastigma)多年生蔓生藤本。全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。三叶青是我国特有珍稀中药植物。《本草纲目》记载“三叶崖爬藤，性味苦、辛、凉，清热解毒、活血祛风”。现代医学研究表明，三叶青对于高热、肺炎、肝炎、胃炎等诸多严重感染性疾病均有显著疗效[1]。尤其是其体内所含的三叶青黄酮、β-谷甾醇、多糖等能很好地抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡[2-4]，且无毒副作用[5]。目前三叶青提取物已在临床上广泛用于抗癌、抗艾滋病毒，治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎、病毒性脑膜炎等[6]，是目前公认的“植物抗生素”。

三叶青主要分布于我国浙江、福建、广西、云南等地，于2018年2月入选新“浙八味”[7]。三叶青喜阴凉湿润气候，尤其是对光照生长环境要求苛刻，自然条件下生长速度缓慢，加上无节制的人为采挖，在自然条件下已濒临灭绝[1]。因此，三叶青被列入浙江省首批农作物种质资源保护名录品种。目前，三叶青需求呈大幅增长趋势，然而，三叶青种植周期相对较长，栽培技术方面的基础研究较少。近年来各地均开展人工栽培驯化，不同种源的三叶青外观性状、药理活性、产量及价格差异悬殊。

本文通过对2个生态型三叶青块根的含水量、醇溶性浸出物、槲皮素、山奈酚和总黄酮含量等主要药用成分进行动态检测，以期为三叶青高产栽培，优良种质筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶青块根取自金华金葫芦珍稀药材开发有限公司种植基地2个生态型三叶青，其中近根部茎的表皮呈紫褐色(简称褐紫藤三叶青，标注为A)，另一生态型的三叶青藤的表面颜色均为青色(简称青色藤三叶青，标注为B)。

1.2 测定方法

1.2.1 水分含量测定

块根挖回后放置于实验室搪瓷盘中，阴干2周后，取供试品2.0 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，打开瓶盖在100～105 ℃干燥5 h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 min，精密称定重量，再在上述温度干燥1 h，冷却，称重，至连续2次称重的差异不超过5 mg为止。

1.2.2 醇溶性浸出物含量测定

三叶青药材粉碎，过二号筛，混合均匀，取样品约2.0 g，称定重量，置250 mL的烧瓶中，精密加70%乙醇50 mL，塞紧，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。

1.2.3 槲皮素、山奈酚含量测定

取干燥的三叶青药材，经粉碎后过4号筛，取2.5 g样品，精密称定，用25 mL甲醇(内含2%盐酸)加热回流提取2次，每次1.5 h，合并过滤的甲醇定容至50 mL容量瓶中，进样分析前样品溶液用0.45 μm滤膜过滤，即得供试样品溶液。精密吸取以上供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按标准曲线计算供试品溶液中槲皮素、山奈酚含量。其中色谱条件为色谱柱YMCODS柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱温30 ℃，以甲醇-0.2%磷酸(55∶45)为流动相；流速1.0 mL·min-1；检测波长为360 nm，槲皮素、山奈酚的理论塔板数均大于10 000，分离度均大于1.5。

1.2.4 总黄酮含量测定

精密称取干燥至恒重芦丁对照品10.02 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，备用。取三叶青样本粉碎后过50目筛，取0.5 g置圆底烧瓶中，精密称定，加甲醇50 mL，加热回流提取2次，每次1 h，取出放冷，滤过，滤液挥干，残渣用适量甲醇溶解转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀备用。精密吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，精密加入5% 亚硝酸钠溶液l.0 mL，摇匀，放置6 min，再精密加入10% 硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，精密加入氢氧化钠试液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，于500 nm 处测定吸收度。以吸收度值A为纵坐标，芦丁对照品的浓度(mg·L-1)为横坐标，绘制标准曲线，构建黄酮浓度与吸光度关系的回归方程。

精密吸取供试品溶液6.0 mL，置25 mL容量瓶中，其余操作同“标准曲线的制备”，于500 nm处测定吸收度。

1.3 数据处理

槲皮素、山奈酚对照品，芦丁对照品(中国药品生物制检定所)，甲醇、异丙醇均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。所有检测均由浙江中医药大学实验室测试完成。所有测量均3次重复求其平均值。Excel 10.0完成作图。

2 结果与分析

2.1 含水量

通过不同月份晾干后三叶青块根水分含量动态测量(图1)表明，1—7月三叶青块根含水量整体波动不大，且相对较高(含水量大于11.0%)；8—12月，三叶青块根含水量整体呈下降趋势，整体含水量低于11.0%。从整年数据来看，2个样品在5月和9月出现波峰，推测与期间植物块根的快速膨大生长有关。

图1 不同月份三叶青阴干后含水量

2.2 浸出物含量

由图2可知，三叶青的浸出物含量全年相对稳定，整体在8%～10%波动。三叶青A样品的浸出物含量高于B样品。样品A全年平均值为9.14%，样品B为8.52%。经检验，两者无显著差异(P>0.05)。

图2 不同月份三叶青浸出物含量

2.3 槲皮素和山奈酚含量

通过对2个生态型三叶青块根槲皮素和山奈酚含量的测量发现，其含量波动较大。样品B的槲皮素含量在上半年(1—6月)整体高于样品A，而样品B的山奈酚含量上半年则整体低于样品A(图3，图4)。另外，从图3可以看出，2个样品的槲皮素含量在冬季(12—3月)较高。从图4可以看出，A样品山奈酚含量整体较高，尤其在1—5月，A样品山奈酚含量显著高于B样品；在下半年B样品山奈酚含量整体呈上升趋势，而A样品山奈酚含量则呈W形状波动。

图3 不同月份三叶青槲皮素含量

图4 不同月份三叶青山奈酚含量

2.4 总黄酮含量

从图5可以看出，A样品的总黄酮含量在相同时间点整体高于B样品。A样品的三叶青块根总黄酮量在秋冬季相对较高，不同月份波动较大；而B样品总黄酮含量在春夏季比较稳定，且含量相对较低，在秋冬季上升比较明显。

图5 不同月份三叶青总黄酮含量

3 小结

浙江主产的三叶青有褐紫藤三叶青和青色藤三叶青2个生态型品种。民间及育种者往往认为褐紫藤生态型品质更佳[8]，然而两者之间的详细比较鲜见报道。为此，本文选用褐紫藤三叶青(A样品)和青色藤三叶青(B样品)进行成分动态检测。结果表明，2个生态型的含水量和浸出物含量变化基本一致，而槲皮素、山奈酚和总黄酮含量差异较大。这表明2个生态型三叶青块根在药用成分上存在差异。

三叶青作为民间抗肿瘤用药，尚无法定标准对其质量进行控制。迄今相关研究仅针对已采收样品进行分析，通过测定单一组分或者单一类成分的含量作为评价和控制其质量的方法，具有片面性和不确定性[9]。通过对三叶青醇溶性浸出物的测定可知，A样品醇溶性浸出物全年平均含量为9.14%，B样品醇溶性浸出物全年平均含量为8.52%。由此可见，A样品整体达到相关规定，而B样品略低于规定标准。通过测定，从槲皮素含量来看，B样品在3月达到峰值，为0.071 mg·g-1，B样品在12月最高，达到0.084 mg·g-1；从山奈酚含量来看，A样品在春冬季较高，而B样品在秋冬季相对较高。2种含量变化趋势不一致。本试验结果表明，三叶青块根中的总黄酮含量全年波动虽然较大，但样品A的含量整体高于样品B，尤其是在冬季，其差异较为显著。从醇溶性浸出物、槲皮素、山奈酚和总黄酮含量4个指标整体来看，A样品略优于B样品。因此，认为在后续的三叶青质量标准控制研究中可将总黄酮含量测定作为质量控制的主要指标。这与吉庆勇等[10]的观点相一致。

三叶青喜凉爽气候，耐旱，忌积水，在25 ℃左右生长健壮，冬季气温降至10 ℃时生长停滞。12月A样品水含量只有9.75%，B样品水含量只有8.92%，都不足10%，此时三叶青植物体内的水分含量全年最低，且此时三叶青块根有效成分含量较高，品质较好。因此，建议三叶青在冬至与惊蛰期间进行采挖。