低温胁迫下马铃薯组培苗生理变化及抗寒性评定

白淼，王舰,2,3,4,5，王芳,2,3,4,5*

(1.青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016；2.青海省农林科学院 生物技术研究所，青海 西宁 810016；3.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁 810016；4.青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海 西宁 810016；5.青海省马铃薯育种重点实验室，青海 西宁 810016)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)属于茄科茄属类农作物[1]，起源于南美洲安第斯山，为一年生双子叶植物。在西方国家马铃薯有“地下苹果”“第二面包”和“长寿食品”之称[2]，现已成为世界第四大粮食作物[3]，也是我国重要的蔬菜和经济作物[4]。

马铃薯栽培种喜冷凉环境，但不耐霜冻。低温会对马铃薯植株的生长造成很大的危害，严重时导致大面积减产，甚至绝收[5]。门福义等[6]研究发现，当温度低于7 ℃后，马铃薯植株就会停止生长，温度低于-3 ℃时就会导致植株冻死。当温度在12 ℃以下时，马铃薯植株不开花，仅形成花芽；当温度达到16 ℃以上，植株才可以正常开花[7]。低温不仅会抑制植株的生长发育，还会影响植株的光合作用。李飞[8]发现，马铃薯栽培品种在幼苗时期遭受低温冻害时叶片受到损伤并停止生长，导致光合作用受阻，严重影响马铃薯的产量，甚至会造成绝收。低温对植物的生理指标也会产生一定的影响。吴雁斌等[9]研究发现，在4 ℃时，陇薯3号和陇薯6号试管苗的丙二醛、游离脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)、POD、CAT活性上升，可溶性蛋白、叶绿素含量降低，以此来适应和抵御低温胁迫。杨超英[10]研究发现，在冷驯化期间，马铃薯幼苗体内的脯氨酸含量总体呈上升趋势；不同马铃薯品种体内的SOD活性也不同，耐冻性强的品种比耐冻性弱的品种体内SOD活性强，脯氨酸含量的变化和SOD活性可作为鉴定不同马铃薯品种耐冻性的评价指标。李飞等[11]研究发现，在冷驯化期间耐冻品种和中薯3号叶片内可溶性糖和可溶性蛋白含量均有所升高。王华等[12]发现，低温胁迫下，SOD、POD、CAT 活性随温度的降低总体上呈先升高后降低的趋势，表明酶活性随外界环境变化而变化。陈巧巧[13]发现，低温胁迫下，马铃薯叶片MDA含量总体呈增加趋势；在施加外源蔗糖后，MDA含量降低，在一定程度上减轻了膜的氧化作用。

本研究以马铃薯品种DR-2和费乌瑞它组培苗为试验材料对其进行低温胁迫，测定马铃薯组培苗中的SOD活性、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸、总蛋白等生理指标含量的变化，对其进行相关性分析，鉴别各指标之间的相关性；运用隶属函数法对马铃薯抗寒性进行综合评价，为马铃薯抗寒性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯品种费乌瑞它和DR-2组培苗，由青海省农林科学院生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

参照杨超英[10]方法并略作改动，将费乌瑞它和DR-2组培苗在MS培养基上培养15 d后，选取生长良好、长势一致的组培苗用于试验。对照组转入人工气候培养箱中，气候箱温度为白天20 ℃、晚上18 ℃，光照强度为10 000 lx，光照时间为12 h。处理组进行低温胁迫处理，温度为4 ℃[11]，光照强度为10 000 lx，光照时间为12 h，设置3次重复。分别处理0、1、3、5、7 d后，在相应处理时间下取马铃薯组培苗，整株混匀后放入1.5 mL离心管中，用于测定不同处理下的生理指标。

1.2.2 测定指标及方法

SOD活性、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均采用南京建成试剂盒测定，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，浓硫酸(分析纯)由本实验室提供。

1.3 数据处理

利用Excel 2010进行数据处理和制图，利用SPSS 22.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 对马铃薯组培苗生理指标的影响

2.1.1 可溶性糖含量

从图1可看出，随着低温胁迫时间的延长，DR-2和费乌瑞它组培苗中可溶性糖含量呈先增加后降低的变化趋势。其中，DR-2可溶性糖含量的峰值出现在第5天，达23.54 mg·g-1；费乌瑞它可溶性糖含量的峰值出现在第3天，达23.54 mg·g-1。不同胁迫时间下的费乌瑞它可溶性糖含量间存在显著性差异。除胁迫第3天外，DR-2的可溶性糖含量均高于费乌瑞它。

同品种柱间无相同小写字母表示胁迫时间组间存在显著差异(P<0.05)。图2～5同。

2.1.2 可溶性蛋白含量

从图2可以看出，随着胁迫时间的延长，DR-2和费乌瑞它组培苗中可溶性蛋白含量呈现先升高后降低的趋势。其中，DR-2各处理之间可溶性蛋白含量存在显著性差异；费乌瑞它在胁迫第0和第3天的可溶性蛋白含量没有显著差异，在第5天突然升高，与第3天形成显著差异，第7天仍维持较高水平。2个马铃薯品种可溶性蛋白含量的峰值均出现在第5天，其中DR-2含量达7.53 μg·g-1，费乌瑞它含量达15.26 μg·g-1，均显著高于对照组。

图2 低温胁迫下马铃薯组织中可溶性蛋白含量的变化

2.1.3 游离脯氨酸含量

从图3可以看出，随着胁迫时间的延长，DR-2和费乌瑞它组培苗中游离脯氨酸含量均呈现先增加后降低的趋势。其中，DR-2组培苗组织中游离脯氨酸含量的峰值出现在第5天，达354.24 μg·g-1；费乌瑞它的峰值出现在第3天，达163.00 μg·g-1。在不同胁迫时间下，2个品种游离脯氨酸含量均存在显著性差异；在同一胁迫天数下，DR-2中游离脯氨酸含量明显高于费乌瑞它。相比胁迫0 d的对照，2个马铃薯品种在受到胁迫后，脯氨酸含量明显增加。

图3 低温胁迫下马铃薯组织中脯氨酸含量的变化

2.1.4 SOD活性

从图4可以看出，2个马铃薯品种组培苗中SOD活性变化趋势有所不同。随着胁迫时间的延长，DR-2组培苗SOD活性呈现先升高后降低的趋势，峰值出现在第1天，含量达到847.35 U·g-1，SOD活性相比对照明显增加。费乌瑞它组培苗SOD活性呈现先升高后降低再升高又降低的趋势，总体上SOD活性相比对照变化不大。在不同胁迫天数下，2个品种SOD活性存在显著性差异。

图4 低温胁迫下马铃薯组织中SOD活性的变化

2.1.5 总蛋白浓度

从图5可以看出，随着胁迫天数的增加，DR-2和费乌瑞它组培苗中总蛋白浓度均呈下降趋势，且均存在显著性差异。在胁迫初期，2个马铃薯品种总蛋白浓度均下降明显；随着胁迫时间的延长，总蛋白浓度降幅减缓，在胁迫第7天时，2个马铃薯品种间浓度相差不大。

图5 低温胁迫下马铃薯组织中蛋白质浓度的变化

2.2 马铃薯生理指标之间的相关性

由表1可以看出，可溶性糖含量与脯氨酸含量呈极显著正相关，相关系数为0.741，与总蛋白浓度呈显著负相关，相关系数为-0.487；可溶性蛋白含量与总蛋白浓度呈极显著负相关，相关系数为-0.697；其余指标之间相关性未达到显著水平。

表1 低温胁迫下马铃薯各生理指标的相关性分析结果

2.3 马铃薯品种抗寒性综合评价

隶属函数法是一种广泛应用的植物抗逆性综合评定法，参照杨金红[14]的方法对2个马铃薯品种进行抗寒性综合评价。

若某指标与抗寒性呈正相关，则X(u)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)；若某指标与抗寒性呈负相关，则X(u)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)。其中，X(u)是各指标的隶属度值；X是某指标的测定值；Xmin是某指标测定值中的最小值；Xmax是某指标测定值中的最大值。用隶属函数法评定时，各指标隶属函数值的平均值越大，则抗寒性越强。

由表2可以看出，马铃薯品种DR-2的隶属度平均值大于费乌瑞它，说明马铃薯品种DR-2的抗寒性高于费乌瑞它。

表2 马铃薯品种抗寒性综合评价

3 讨论

低温是植物所面临的重要非生物胁迫，影响植物的生长发育。在低温胁迫下，植物体内会产生一系列生理响应，在不同程度上保护植物的生长，当胁迫程度超过植物抵御极限时，就会导致植物死亡[15]。植物在低温环境中可以通过积累渗透调节物质，保持细胞内部渗透平衡，以此来抵御逆境伤害。研究表明，植物抗寒性的强弱与可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸的含量有关[16]。作为一种亲水性强的蛋白,可溶性蛋白的增加可以提高细胞保水能力，从而减少原生质结冰而导致的植物致死。研究表明，可溶性蛋白含量的增加与植物抗寒性呈正相关关系[17]；许娟等[18]研究表明，在低温胁迫下，4个马铃薯品种苗期叶片可溶性蛋白含量总体上呈先上升后下降趋势，峰值出现在第2～3天。本试验结果表明，2个马铃薯品种可溶性蛋白含量也呈先上升后下降趋势，与其趋势基本保持一致。

作为植物体内重要的组成成分之一，糖类也是重要的营养物质和贮存物质。杨慧菊等[17]研究表明，马铃薯的抗寒性与其叶片中可溶性糖含量的积累有关；李飞等[11]研究发现，经过冷驯化马铃薯叶片内可溶性糖含量呈增加趋势，其中耐冻野生马铃薯材料03079-435可溶性糖含量的增幅高于霜冻敏感的中薯3号。本试验结果表明，随着胁迫时间的延长，马铃薯组织内可溶性糖含量呈先增加后降低趋势，但相比对照明显增加，说明可溶性糖含量的增加与马铃薯的抗寒性存在一定关系，这与李飞的研究结果基本一致。

游离脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，可作为植物抗逆性的一项生化指标。脯氨酸含量的增加能够提高细胞液浓度，有利于细胞保水，也可作为活性氧清除剂来增强细胞内CAT、SOD等酶的活性。研究认为，马铃薯的抗寒性与植株体内的脯氨酸含量有高度相关性，在低温胁迫下，抗寒性强的马铃薯品种植株内脯氨酸的含量越高[18-20]。在本试验中，低温胁迫下马铃薯品种DR-2和费乌瑞它组织内脯氨酸含量呈先增加后降低趋势，在胁迫第5～7天时，DR-2的脯氨酸含量显著高于费乌瑞它。

酶作为一种活性催化剂在生物体内发挥作用，抗氧化酶系作为植物的主要防御酶系起到清除植物体内的自由基作用。其中，超氧化物歧化酶(SOD)能够催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，生成氧和过氧化氢，对植物体内氧化和抗氧化平衡起着重要作用[21]。本试验研究发现，费乌瑞它组培苗组织中SOD活性呈现先升高后降低再升高又降低的趋势，2个马铃薯品种中SOD活性随着胁迫时间的延长总体上也呈现先升高后降低趋势；当低温胁迫进行到第5天时，马铃薯品种DR-2和费乌瑞它组织内SOD含量分别是对照的2.8和1.0倍。本试验发现，在胁迫后期(5～7 d)，DR-2的可溶性糖含量、游离脯氨酸含量和SOD活性均高于费乌瑞它，这可能是DR-2的抗寒性高于费乌瑞它的原因。

低温胁迫下植物的抗性反应是一个复杂的生理生化过程，仅靠酶活性或渗透调节物质等单一指标很难准确评价马铃薯品种的抗寒性。主成分分析法、隶属函数法等是常用植物抗逆性的综合评价方法[14]。主成分分析法是通过降维的思想，将原来众多指标重新组合成一组新的互不相关的综合指标，使结果更加客观、准确。杨凤翔等[22]通过此方法对不同草莓品种进行抗寒性的综合评价。隶属函数法则是通过模糊数学原理进行综合评价的一种方法，已成功应用于马铃薯[17,20]、石楠等[14]多种植物的抗性综合评价。本试验采用隶属函数法通过5个生理指标对2个马铃薯品种进行抗寒性综合评价，使评价结果更加客观、准确。