负载多柔比星的EGFR 靶向光敏脂质体对胃癌细胞的杀伤作用研究

刘松格 谷见法 潘琼

（郑州市中心医院肿瘤内科，河南 郑州 467000）

胃癌是世界范围内死亡率第二的恶性肿瘤，其中约90%为腺癌[1]。根据世界卫生组织统计，全球每年因胃癌死亡的人数（约700,000人）占所有恶性肿瘤死亡人数的10.4%[2]。近年来，胃癌的发病率也呈逐年上升的趋势，全球每年约有930,000的新发病例[1,2]。

目前，手术仍然是胃癌治疗的主要方法。然而，大多数患者在确诊后已经处于晚期，无手术指征，对于这部分患者，化疗仍然是最重要的治疗手段[3]。此外，对于相当一部分行根治性胃癌切除术的患者，术前的新辅助化疗及术后的辅助化疗仍然发挥着重要的作用。但是，尽管许多化疗药物在临床前实验中能够很好的杀伤肿瘤细胞，剧烈的毒副作用大大限制了其临床应用[4]。

纳米医学是近年来新兴的一门边缘学科，纳米药物能够利用肿瘤组织和正常组织在血管内皮细胞间隙上的差异，通过增强的渗透与滞留效应特异性地在肿瘤组织富集，大大提高了恶性肿瘤治疗的效果并降低了治疗相关的毒副作用[5-7]。目前，在常用的纳米载药体系中，脂质体的研究和应用最为成熟[5]。本研究通过薄膜水化法，制备出了一种靶向表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的紫外线反应性的脂质体，其具有较好的稳定性和组织相容性，能将负载的化疗药物靶向输送至肿瘤组织，在体内、外研究中显示出很强的肿瘤杀伤效应，具有广阔的临床应用前景。

1 材料方法

1.1 细胞培养

人胃腺癌细胞株NCI-N87（以下简称N87）购自美国模式培养物保藏所，保存于本实验室。细胞用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的伯克改良伊格尔（Dulbecco modified eagle medium，DMEM）培养基（GIBCO公司）于37℃，含5% CO2的细胞培养箱内传代培养。

1.2 主要试剂

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）购自碧云天生物技术研究所；联乙炔基甘油磷脂酰胆碱（Diacetylenic glycerophosphatidylcholine，PC）和mal-PEG购自美国Avanti Polar Lipids公司；西妥昔单抗（Certuximab）购自罗氏制药股份有限公司；盐酸多柔比星（Doxorubicin，DOX）购自大连美仑生物科技有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）细胞增殖与活性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所（DOJINDO）。

1.3 负载多柔比星的光敏纳米脂质体的制备

1.3.1 Certuximab Fab’片段的制备及硫醇化修饰

参照Gao等人的方法[8]制备Certuximab的Fab’片段并进行硫醇化修饰。将浓度为10 g•kg-1的Certuximab与胃蛋白酶于37℃共育6 h后，用葡聚糖凝胶层析柱（Sephadex G-150 column）进行纯化，将得到的Certuximab的F(ab)2片段再用木瓜蛋白酶进行水解，同样的方法进行纯化，得到抗体的Fab’片段。将Certuximab的Fab’片段与2-亚氨基噻吩（2-iminothiolane，2-IT，Sigma-Aldrich公司）按照质量比1:0.15的比例混合，室温下轻轻振荡反应2 h时，并用透析法除去游离的2-IT，得到硫醇化修饰的Certuximab的Fab’片段（Fab’-SH）。用同样的方法制备硫醇化修饰的BSA（BSA-SH）。

1.3.2 负载多柔比星脂质体的制备[5,9]

称取1.8 mgPC和0.2 mg的mal-PEG，混合溶解于氯仿与甲醛的混合溶液中（V氯仿/V甲醛=1），震荡混匀后静置10 min，室温旋转蒸发至溶剂完全挥发，使磷脂在旋蒸瓶内壁形成一层薄膜，后用含0.5 g·kg-1DOX的中性磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffered solution，PBS）溶液在旋蒸瓶中缓慢旋转洗涤，得到负载DOX的脂质体溶液。然后将得到的脂质体溶液依次用0.8 μm、0.4 μm和0.2 μm的聚碳酸酯膜缓慢过滤，并用透析法（截留分子量MWCO: 3000 KDa）去除游离的DOX，得到粒径均匀的脂质体。将制备的脂质体与1.3.1制备的Fab’-SH或BSA-SH于4℃反应过夜后，透析法除去游离的抗体Fab’片段或BSA，得到Fab’或BSA表面修饰的脂质体（本文中分别标记为PDF和PDB）。

1.3.3 负载多柔比星脂质体的紫外交联

将1.3.2制备的脂质体用紫外分光光度计（Stratalinker-UV 1800）照射，以进行交联。照射条件：紫外波长254 nm，剂量：360 g·kg-1，反应循环数：20，反应条件：4℃[10,11]。将成功制备的载药纳米脂质体与透射电镜下观察形态，并用动态光散射仪检测其粒径大小。

1.4 光敏纳米脂质体的体外稳定性检测

以含50%胎牛血清的DMEM缓冲液在体外模拟人体的血液环境，将脂质体置于其中于37℃进行孵育，不同时间点取出溶液，动态光散射仪检测比较脂质体的粒径大小和分散系数的变化[11]。

1.5 脂质体药物负载DOX的释放

取5 ml负载DOX的脂质体溶液，紫外分光光度计检测其浓度（C1），将其置于透析膜（MWCO：3000 kDa）内，将该体系置于含有500 ml PBS缓冲液的烧杯中避光透析，分别与不同时间点取烧杯内的缓冲液300 μL，紫外分光光度计于488 nm检测其中DOX的浓度（C2），然后按照下面的公式计算从脂质体中释放的DOX的比例[12]：被释放的多柔比星%=C2×500mlC1×5 ml×100%。

1.6 N87细胞对脂质体药物的内吞能力检测

取生长对数期的N87细胞（5×104），将其分别与浓度为1 g·kg-1的游离DOX，PDB和PDF于细胞培养箱中孵育，以不含DOX的DMEM培养基作为阴性对照组，4 h后，流式细胞术检测N87细胞内的平均红色荧光强度，比较细胞内DOX的含量[13]。

1.7 光敏纳米脂质体对淋巴瘤细胞的体外杀伤能力检测

将生长对数期的N87细胞置于96孔细胞培养板中培养（3000·孔-1），分别向其中加入相应浓度的游离DOX、PDB和PDF，不含DOX的DMEM培养基作为阴性对照组（NT），48 h后，向每个孔中加入CCK-8 10 μL，避光静置2 h后，micro-plate reader（Thermo Multiskan MK3, Thermo Scientific）读取每个孔在450 nm的吸光值（Ab），并按照如下公式计算细胞活力[14]：

其中，AbBlank为不含N87细胞的空白对照孔的吸光值。

1.8 脂质体药物对荷瘤小鼠皮下肿瘤的抑制效果

将16只6周龄雌性BALB/c裸鼠（购自成都达硕实验动物公司）于无菌条件下饲养至8周龄后，皮下注射1×107的N87细胞，待小鼠的皮下肿瘤生长至长径约10 mm后，将荷瘤小鼠随机分为四组，每组4只，分别经尾静脉注射游离DOX、PDB和PDF，每组DOX的剂量为5 g·kg-1，尾静脉注射等体积的PBS作为阴性对照（隔日1次×3次）。密切观察小鼠状态，每日测量小鼠肿瘤体积。在整个实验周期（49 d）结束后，用颈椎脱臼发处死小鼠。所有动物实验均经过郑州市中心医院伦理委员会的同意，并严格按照郑州市中心医院（大学）实验动物章程进行操作。小鼠肿瘤体积按照Peng H等的方法进行测量和计算[15]：

1.9 统计学分析

所有数据采用SPSS11.0进行统计学分析，对于两组均数的比较采用非配对t检验进行分析；对于3组及以上均数的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学分析，并以Dunnettt检验进行组间两两比较；对于小鼠的生存率采用log-rank法进行生存分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EGFR靶向光敏脂质体的表征

透射电镜下脂质体为均匀分布的球状，且具有清晰的核壳结构，见图1。动态光散射结果显示见表1，在经过紫外线交联后，脂质体的直径为从117.2±28.5 nm下降至82.3±10.3 nm，脂质体溶液的多分散系数（Polydispersity index，PDI）从0.14下降至0.09，说明经过紫外交联后的脂质体，具有更加紧密和均一的结构。此外，紫外分光光度计检测结果显示本研究制备的溶液中DOX的终浓度为0.20 g·kg-1，而载体的浓度为0.91 g·kg-1，据此可计算出本研究制备的脂质体药物，其载药量约为21.98%，包封率为40%。

图1 透射电镜观察光敏脂质体的显微形态

表1 光敏脂质体交联前后粒径变化

2.2 紫外交联能显著提高光敏脂质体的稳定性

将脂质体在模拟人体血液环境中孵育24 h后，交联后的脂质体，其粒径大小及分布的变化比未交联的脂质体显著减小、稳定性提高，见表2。

表2 紫外交联前后光敏脂质体的稳定性比较

2.4 紫外交联不会影响脂质体内药物的释放

在48 h和72 h后，交联后的脂质体能分别将释放约69.5%和77.3%的DOX，而未交联的脂质体则分别能将约82.8%和89.7%的DOX释放出来，见图2。可见，紫外交联可以降低脂质体内药物的释放，由于>70%的药物在48 h后能够成功从脂质体中释放出来，因此这种药物的缓释并不会对其负载的化疗药物的细胞毒作用造成显著的负面影响。

图2 紫外交联前后，脂质体负载DOX 的释放情况比较

2.5 靶向光敏脂质体能增强细胞对药物的摄取

流式细胞术结果显示，脂质体药物孵育后，N87细胞内的红色平均荧光强度较游离药物组有显著增强（P<0.05），而相比之下，PDF组N87细胞内的荧光强度较PDB组增加更多（P<0.05），见图3。

图3 流式细胞术检测肿瘤细胞对脂质体药物内吞能力检测

2.6 脂质体能够显著增强药物对细胞的杀伤效果

在各个治疗浓度下，PDF治疗组N87细胞的细胞活力较游离DOX治疗组及PDB治疗组显著下降，PDF对N87细胞的半数抑制浓度（Half inhibitory concentration，IC50）较PDB及游离DOX有显著降低（P<0.05），见图4。

图4 游离DOX 及脂质体药物对N87 细胞体外杀伤能力比较

2.7 靶向光敏脂质体能够显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤生长

与PBS对照组相比，游离DOX治疗组能够轻度一直荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长，PDB能显著抑制荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长，而相比之下，PDF对小鼠皮下肿瘤的抑制能力较PDB和游离DOX更强（P<0.05），见图5。

图5 靶向脂质体能够显著抑制荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长

3 讨论

化疗是临床上恶性肿瘤治疗的主要手段之一，其在恶性肿瘤的术前新辅助化疗、术后辅助化疗以及晚期的姑息治疗中发挥着越来越重要的作用。然而，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织和细胞有很强的毒副作用，这大大限制了其临床应用[16,17]。近年来，纳米医学的发展，为解决化疗药物的高毒性问题提供了新的有效方法。研究表明，正常组织内，血管内皮细胞的间隙一般＜7 nm，而肿瘤组织内由于血管异型增生，其内皮细胞间隙增大，约为200-700 nm。因此，粒径在数十到数百纳米之间的纳米药物可以通过肿瘤组织的内皮细胞间隙，但却不能通过正常组织的内皮细胞间隙，使得其能够在肿瘤组织内部特异性富集，这种效应被称之为增强的渗透与滞留效应[18]。纳米药物的这种效应，使得其在肿瘤治疗领域得到了越来越广泛的应用。

研究表明，纳米药物的稳定性是影响其疗效的主要因素之一[9,12]。为了增强纳米载药体系的稳定性，本研究利用PC成功制备出一种对紫外线敏感的脂质体。PC是一种二炔磷脂，其分子中的两个炔基在紫外线照射后可以在两个分子之间形成共价键连接，这使得脂质体的脂质双分子层之间的连接更加紧密，这种紧密的连接大大增强了脂质体的稳定性[9,12]。本研究的研究结果显示，经过交联后的脂质体，在体外模拟血液环境中的稳定性较未交联的脂质体有显著的提升。

为增强脂质体的靶向性，本研究用靶向EGFR抗体Certuximab的Fab’片段对脂质体的表面进行了的修饰。结果表明，与游离药物相比，脂质体药物能显著提高肿瘤细胞对药物的摄取，增强负载化疗药物对胃癌细胞的毒性，而Fab’片段的靶向修饰则进一步提高了肿瘤细胞内的药物浓度和毒性。体外实验中我们得到了与体内实验相一致的实验结果。靶向脂质体的这种较强的体内外肿瘤杀伤效应主要是由于下原因：（1）脂质体药物的稳定的球状结构增强了肿瘤细胞的摄取；（2）纳米药物通过高渗透长滞留效应，增强了在肿瘤组织内部的富集；（3）抗体Fab’片段的表面修饰，使脂质体药物通过抗原-抗体的识别和结合，进一步增强了其在肿瘤组织内部的富集以及肿瘤细胞对脂质体药物的摄取。

综上所述，本研究制备的靶向EGFR的光敏脂质体，拥有很好的稳定性，在体内、外研究中显示出很强的非霍奇金淋巴瘤杀伤效果，具有广阔的临床应用前景。