RNF144A基因在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义*

王智浩，曹如柔，蒋 帆，刘 韵，蒋益兰

(1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院肿瘤科，湖南 长沙 410006)

皮肤恶性黑色素瘤(SKCM)是恶性程度很高、侵袭能力很强，发生在皮肤中的恶性肿瘤，占所有皮肤恶性肿瘤的5%，是死亡率最高的皮肤癌类型[1]。虽然转移性黑色素瘤新疗法广泛应用使SKCM的死亡率有所下降，但SKCM的发病率依旧在持续增加[2-3]。RNF144A基因是泛素化蛋白编码基因家族中的重要成员，参与蛋白质定位、转运、修饰及蛋白质间的相互作用[4-6]。泛素化过程涉及细胞周期调控、染色体有丝分裂、核酸损伤修复[7-9]。有研究发现，RNF144A基因在帕金森病[10]、肺纤维化[11]、心力衰竭[12]、乳腺癌[13]等疾病中作用显著。本研究采用数据挖掘的方法，分析RNF144A在SKCM中的作用及对其预后的影响，为SKCM的精准诊断及治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1RNF144A 基因在不同肿瘤组织中表达差异性分析 GEPIA是基于TCGA和GTEx数据库中的肿瘤和正常样本进行基因表达分析的网站[14]。通过GEPIA数据库 (http://gepia2.cancer-pku.cn)分析不同肿瘤间RNF144A基因的差异性表达。进入网站后选择single gene analysis，输入RNF144A，在GeneralInformation中查看分析结果。

1.2RNF144A 基因在SKCM中表达差异性分析 Oncomine数据库是癌症微阵列数据库和基于Web的数据挖掘平台，可以通过此数据库对肿瘤临床和病理学进行探索，采用t检验的方法进行差异分析[15]。通过Oncomine数据库(http://www.oncomine.org)分析SKCM组织与癌旁组织中mRNA差异性表达。检索条件：(1)Analysis type:Melanomavs.Normal analysis；(2) Cancer type:Cutaneous melanoma；(3) Data type:mRNA；(4)Concept type:Over-expression (Oncomine concepts)。

1.3RNF144A基因在SKCM中表达的亚组分析 UALCAN数据库是使用癌症基因组图谱(TCGA) 3级RNA-seq和来自31种癌症类型的临床数据对基因、临床表型及疾病进行深入分析的交互式网络门户[16]。通过UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)对RNF144A基因在SKCM中的表达进行样本类型、肿瘤分期、年龄、体重、性别、种族的亚组分析，以箱线图展示。进入网站后，在TCGAanalysis界面输入RNF144A，TCGA dataset选择SKCM，然后在Links for analysis栏选择Expression。

1.4基于OncoLnc网站进行生存分析 OncoLnc网站包含了TCGA进行的21项癌症研究中8 647例患者的生存数据，用户能够通过基因表达区分患者并进行Kaplan-Meier生存分析[17]。通过OncoLnc网站(http://www.Oncolnc.org)绘制RNF144A基因表达与SKCM患者生存周期相关曲线。进入网站后输入RNF144A，选择SKCM，在Kaplan plot for RNF144A in SKCM的界面中，LowerPercentile和Upperpercentile分别输入50、50。

1.5SKCM中RNF144A基因的共表达基因 通过UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)查找SKCM中RNF144A基因的共表达基因。进入网站后，在TCGAanalysis界面输入RNF144A，TCGA dataset选择SKCM，然后在Links for analysis栏选择Correlation。

1.6String 蛋白网络分析 String蛋白网络分析可预测蛋白质与蛋白质相互调控网络[18]。通过String数据库(https://string-db.org/)预测RNF144A蛋白的上下游调控蛋白及蛋白间的相关调控关系。检索条件：(1) Portein name：RNF44A；(2) Organism：auto-detect。

2 结 果

2.1RNF144A 基因在不同肿瘤类型中的差异性表达 通过GEPIA数据库分析发现，RNF144A在急性髓系白血病(LAML)、SKCM、胃腺癌(STAD)、胸腺瘤(THYM)中高表达，在宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、子宫内膜癌(UCUC)、子宫内膜肉瘤(UCS)中低表达。见图1。

2.2RNF144A基因在SKCM中表达差异性分析 通过Oncomine数据库分析SKCM中RNF144A基因转录水平，共有2个数据源，分别来自RIKER等[19]和TALAN TOV等[20]研究，共计137个样本(图2)。对这些数据进行差异性分析发现，RNF144A转录的mRNA在SKCM中高表达，与其在正常组织中的表达比较，差异有统计学意义(P=0.001)。

图1 GEPIA数据库中RNF144A在不同肿瘤中差异性表达

图2 Oncomine数据库中在SKCM中基因差异性表达

2.3RNF144A基因在SKCM中基因表达的亚组分析通过UALCAN网站对RNF144A基因在SKCM中表达进行样本类型、肿瘤分期、年龄、体重、性别、种族的亚组分析,发现RNF144A在男性SKCM患者中的表达明显高于RNF144A在女性SKCM患者中的表达存在显著差异(P=0.003)(图3C),在其余亚组分析即不同样本类型的SKCM中、不同肿瘤分期的SKCM中、不同种族的SKCM中、不同年龄的SKCM中、不同体重的SKCM中RNF144A的表达差异无统计学意义(图3A、3B、3D、3E、3F)。

2.4基于OncoLnc网站的生存曲线 通过OncoLnc网站绘制RNF144A基因表达与SKCM患者生存周期相关曲线，RNF144A高表达组与低表达组样本各有229例，绘制生存曲线发现(图4)，RNF144A高表达组患者生存周期较低表达组明显降低，差异有统计学意义(P=0.00 165)。

2.5SKCM中 RNF144A基因的共表达基因 通过UALCAN数据库查找发现Pearson-CC大于0.5的基因有602个，按Pearson-CC降序排列，选取前25个基因，绘制RNF144A基因在SKCM中共表达基因的热图(图5)，这些基因分别是PRKCE、C2orf29、HMG20A、USP39、SLC35E3、KCMF1、POLR1A、MSI2、RNF115、PTCD3、LRPPRC、C2orf44、PNO1、UBXN2A、POLR2D、MARS2、E2F6、PPP3R1、C2orf43、FAM168B、CTBP2、ADSS、GPN1、IMMT。

A.不同样本类型的SKCM中RNF144A的表达;B.不同肿瘤分期的SKCM中RNF144A的表达;C.不同性别的SKCM中RNF144A的表达;D.不同种族的SKCM中RNF144A的表达;E.不同年龄的SKCM中RNF144A的表达;F.不同体重的SKCM中RNF144A的表达;与男性患者比较，aP<0.05。

图4 RNF144A基因不同表达水平的SKCM患者总体生存曲线

图5 SKCM中RNF144A基因的共表达基因热图

2.6RNF144A基因上下游关系预测 在String网站中，分析RNF144A基因上下游关系，得到相应的关系网络图(图6)，PPI富集P值(PPI enrichmentP-value)=0.031 3。相互作用节点数共有11个，分别为PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2。RNF144A基因主要参与蛋白质代谢和蛋白质泛素化。E3泛素蛋白连接酶以硫酯的形式从E2泛素结合酶UBE2L3和UBE2L6接受泛素，然后将泛素直接转移至目标底物。

图6 RNF144A与上下游基因调控关系

3 讨 论

SKCM是恶性程度最高的恶性肿瘤之一[21]。目前，针对SKCM的靶向治疗及免疫疗法取得了突破性进展，并在早期诊断和预防方面获得了不可忽视的进步，但SKCM的预后依旧不容乐观，尤其远处转移的患者，3年生存率不足20%[22-23]。

RNF144A基因是蛋白质泛素化家族基因中的重要成员。泛素化是蛋白质的翻译后修饰，可与细胞质DNA-PKcs相互作用并降解，维持EGFR信号传导，在DNA损伤过程中促进细胞凋亡,在细胞内稳态中发挥核心作用[24-25]。有证据表明，靶向泛素化在恶性肿瘤的治疗及预后中存在巨大潜力[26-27]，但RNF144A基因与SKCM的相关性研究尚缺乏相关报道。

本文通过GEPIA网站和Oncomine数据库分析发现RNF144A基因在SKCM中高表达，基于此结论，RNF144A基因有可能成为一个SKCM分子诊断的新的生物学标记物。基于UALCAN数据库对RNF144A基因在SKCM中表达进行样本类型、肿瘤分期、年龄、体重、性别、种族的亚组分析，发现男性患者的RNF144A基因表达高于女性患者。基于OncoLnc网站的生存分析发现RNF144A基因高表达组患者生存周期明显短于低表达组，提示RNF144A基因的表达与SKCM的预后显著相关，证明了RNF144A基因可作为SKCM治疗的潜在靶点。基于UALCAN数据库的共表达基因发现RNF144A基因在SKCM中存在众多的共表达基因，为进一步的分子机制研究开拓了新的思路。通过String蛋白网络分析发现，RNF144A可能与PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2等蛋白相互作用，这为RNF144A基因表达调控研究提供了方向。

本研究使用不同数据库及在线分析工具分析了RNF144A与SKCM之间的相关性，发现RNF144A在SKCM中高表达，参与肿瘤发生、发展的调控，为进一步实验验证提供了理论依据，同时为SKCM精准诊断及治疗提供了新的思路。