HPLC 法同时测定厚藤不同部位中8 种成分

刘 雯刘 云侯小涛 钟燕妮

（1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；2.徐州医科大学附属医院，江苏徐州 221002；3.广西中药药效研究重点实验室，广西南宁 530001）

厚藤Ipomoea pes-caprae（Linn.）Sweet，系旋花科番薯属草本植物，又称马鞍藤、海滩牵牛、二叶红薯等，在我国主要分布于广西、广东、福建、台湾等东南沿海地区，植物资源丰富［1］。全草入药，具有祛风除湿、拔毒消肿的功效，主治风寒感冒、风湿痹痛、痈肿疔毒，外用治疮疖、痔疮［2］。厚藤主要含香豆素、萜类、黄酮、生物碱、奎尼酸等成分［3-8］。现代研究表明，厚藤具有抗肿瘤、抗菌、抗炎镇痛、抗胶原酶、抗氧化、免疫调节等多种药理活性［9-12］。迄今为止，有关厚藤质量控制方面的研究报道较少。冯小慧等［13-14］建立了厚藤TLC鉴别方法及HPLC 法测定6 种成分的含量。厚藤的传统药用部位是全草，关于其不同部位的比较研究尚未见报道。对中草药不同部位组分差异的研究具有重要意义［15-18］。本研究采用HPLC 法测定了厚藤不同部位（花、叶、果实、嫩茎、老茎）中8 种成分的含量，以期阐明厚藤不同部位之间的差异，为其质量控制、临床应用及资源的合理开发和利用提供参考。

1 材料

Waters e2695 高效液相色谱仪，包括UV 型紫外检测器、沃特世工作站（美国Waters 公司）；PRACTUM224-1CN 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。水为纯净水；甲醇为分析纯；乙腈为色谱纯。对照品绿原酸（批号 110753-201817，纯度96.8%）、咖啡酸（批号110885-201703，纯度 99.7%）、异槲皮苷（111809-201804，纯度97.2%）均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸（批号6630）、隐绿原酸（批号3208）、异绿原酸B（批号3089）均购自购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；异绿原酸A（批号RP180903）、异绿原酸C（批号RP180704）均购自成都麦德生科技有限公司。4 批厚藤信息见表1，经广西中医药大学中药鉴定教研室谭勇教授鉴定为正品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流动相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱，程序见表 2；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，加甲醇制成含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 质量浓度分别为0.150 6、0.801 3、0.144 4、0.180 1、0.645 3、1.485 0、2.442 0、1.258 0 mg／mL的混合对照品贮备液，分别精密量取0.40、0.70、1.00、1.30、1.60 mL 至5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2.2 供试品溶液 取厚藤粗粉（过2 号筛）约2 g，精密称定，置具塞磨口锥形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL 置锥形瓶中，称定质量并记录，回流1 h，取出放凉后，再加70% 甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 系统适用性试验 精密吸取“2.2.1”“2.2.2”项下溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，色谱图见图1。理论板数以绿原酸计，不得低于6 000。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 8 种成分含量测定

2.4.1 线性关系考察 取适量“2.2.1”项下混合对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1”项色谱条件下进样分析。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度试验 取同一份混合对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1”项色谱条件下进样6 次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取厚藤粉末（过2 号筛，编号S1）约2 g，共6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为1.4%、0.9%、1.1%、1.2%、1.5%、0.8%、1.1%、1.2%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 精密称取厚藤粉末（过2 号筛，编号S1）约2 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为 1.7%、2.7%、2.1%、2.0%、3.0%、1.3%、2.9%、1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取厚藤粉末（过2 号筛，编号S1）约1 g，平行称取6 份，按照100%水平精密加入对照品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，计算回收率，结果见表4。

2.4.6 含量分析 取4 批样品的5 个部位（花、叶、果实、嫩茎、老茎），共20 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表5，可知老茎中咖啡酸含量最高，其他7 种成分含量均在叶中最高。

表4 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

3 讨论与结论

分别考察了提取方法、提取溶剂、提取时间，结果发现70%甲醇回流提取1 h 提取率最高。以色谱峰的分离度、峰形、峰面积等为指标考察了液相流动相系统、柱温、检测波长，结果发现乙腈-0.2%磷酸系统效果最佳；327 nm 下各组分有最大吸收，灵敏度高；柱温对结果影响不大，因此选择接近室温的25 ℃。

目前，关于厚藤不同部位比较研究的文献鲜有报道。本研究建立HPLC 法测定4 批厚藤5 个部位中8 种成分的含量，结果发现不同部位之间存在统计学差异，其中老茎中咖啡酸含量最高，其他7 种成分含量均在叶中最高。综上所述，本研究可为厚藤的质量控制、临床应用，以及相关资源的合理开发利用提供依据。

表5 各成分含量测定结果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%）