UHPLC-PDA 法同时测定毛大丁草中6 种成分

游景瑞 孙 佳兰燕宇李勇军王永林刘春花∗

（1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550025；3.贵州医科大学，贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004）

毛大丁草为菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草，是西南地区少数民族用药，具有宣肺止咳、发汗利水、行气活血的功效，常用于治疗伤风咳嗽、哮喘、痈疖等疾病［1-4］。目前，对毛大丁草的研究主要集中在成分的分离提取上［5-7］，已从其不同部位分离得到香豆素类、黄酮类、有机酸等83 个化合物［8-9］，可能是其活性物质［10-11］，具有镇咳、平喘、抗菌、抗肿瘤等药理作用，在医药领域具有很好的应用前景［12-14］，但成分含量测定方法比较单一，如采用RP-HPLC 法、双波长薄层扫描法测定熊果苷含量［15-16］，HPLC 法同时测定大丁苷、8-甲氧基补骨脂素含量［17］，以及对总黄酮含量的测定［18］，基于多成分含量同时测定的研究尚未见报道。目前，毛大丁草质量标准仍不完善，不能较全面地控制其内在质量。课题组前期已经建立毛大丁草的指纹图谱，并指认出熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 等成分［19］；本实验采用UHPLC-PDA 法同时测定毛大丁草中6 种成分的含量，以期为其质量控制方法的建立提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Nexera-i LC-2040C 3D CN 超高效液相色谱仪（UHPLC），包括四元泵、自动进样器、柱温箱、脱气器和光电二极管阵列（PDA）检测器（日本岛津公司）；EL204 电子天平［万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 熊果苷对照品（批号wkq19031511，纯度＞98%）购于四川省维克奇生物科技有限公司；绿原酸（批号170510，纯度＞98%）购于成都植标化纯生物技术有限公司；木犀草苷（批号wkq19013011，纯度＞98%）购于四川省维克奇生物科技有限公司；异绿原酸A（批号AF8112193，纯度＞98%）、异绿原酸B（批号AF7080124，纯度＞98%）、异绿原酸C（批号AF9060921，纯度＞98%）购于成都埃法生物科技有限公司。

甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、乙腈（色谱纯）均购于国药集团化学试剂有限公司；甲酸（色谱纯）购于美国Tedia 公司。毛大丁草由贵州医科大学药学院药用植物学与生药学教研室张旭副教授鉴定为毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 质量浓度分别为1.423 0、0.976 1、0.975 1、0.991 8、0.974 1、1.009 4 mg／mL 的贮备液，经稀释后置同一10 mL量瓶中，30%甲醇稀释至刻度，摇匀，得熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 质量浓度分别为284.59、19.52、19.50、19.84、38.96、20.19 μg／mL 的混合对照品溶液，于4 ℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液 取药材粉末（过3 号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，量取续滤液5 mL 至25 mL 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件 Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～3 min，2% A；3～4 min，2%～10% A；4～7.5 min，10% A；10～13 min，15%～17% A；13～18 min，17% A；18～23 min，17%～28% A；23～25 min，28%～50% A；25～30 min，50%～53% A；30～32 min，53%～95% A；32～33 min，95% A）；体积流量0.28 mL／min；检测波长280、328 nm；柱温40 ℃；进样量5 μL。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性试验 取“2.1”项下混合对照品、供试品溶液，在“2.2”项条件下进样分析，色谱图见图1，可知6 种成分的分离度良好（均＞1.5），杂质干扰小，可用于含量测定。

图1 各成分UHPLC 色谱图Fig.1 UHPLC chromatograms of various constituents

3.1.2 线性关系考察 取“2.1.1”项下混合对照品溶液（溶液①），精密吸取5 mL 置于10 mL量瓶中，30%甲醇定容至刻度，摇匀得溶液②，同法制备溶液③④⑤⑥，稀释成6 个质量浓度的系列混合对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样分析。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果表明各成分在各自范围内线性关系良好。取上述混合对照品溶液，成比例稀释后进样分析，按S／N ＝10、S／N ＝3 分别计算定量限（LOQ）、检出限（LOD），结果见表1。

3.1.3 精密度试验 取同一混合对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下连续进样6 次，测得熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.52%、0.13%、0.95%、0.27%、0.30%、0.34，表明仪器精密度良好。

3.1.4 重复性试验 取同一批药材6 份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，测得熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C含量RSD 分别为0.90%、1.63%、1.61%、1.31%、1.55%、1.67%，表明该方法重复性良好。

3.1.5 稳定性试验 取“2.1.2”项下同一供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下于0、2、4、8、12、24 h 进样，测得熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD分别为0.27%、0.19%、0.41%、0.31%、0.18%、0.34%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.1.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的样品0.25 g，共9 份，置100 mL 具塞锥形瓶中，分别加入50%、100%、150%水平的对照品各3 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，计算回收率。结果，熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 平均加样回收率分别为102.06%、103.37%、104.97%、104.79%、105.21%、104.75%，RSD 分别为1.88%、1.70%、1.20%、1.89%、1.53%、1.25%。

3.1.7 样品含量测定 收集不同产地药材，对熊果苷、绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 含量进行测定，结果见表2。由此可知，6 种成分总含量为1.165 8%～7.244 4%，其中熊果苷平均含量最高，异绿原酸A 次之，最低的是木犀草苷。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

表2 各成分含量测定结果（%， n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents（%， n＝2）

3.1.8 聚类分析和主成分分析 采用SPSS 22.0软件，以6 种成分含量为变量，对30 批药材进行系统聚类分析，采用组间连接法，以欧氏平方距离为测量标准，结果见图2。30 批样品可分成4 类，第一类是S11（贵州凯里），第二类是S19（贵州贞丰）、S28（云南文山）、S29（云南），第三类是S1（贵州贵阳）、S7（贵州贵阳）、S9（贵州凯里）、S14（贵州都匀）、S16（贵州盘县）、S20（四川）、S22（广西）、S25（云南）、S26（云南）、S27（云南），其他16 批为第四类。

图2 30 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of thirty batches of samples

采用SPSS 22.0 软件，以6 种成分含量为变量进行主成分分析，首先对变量进行标准化，然后计算特征值、贡献率和累积贡献率。第一主成分的特征值是4.541，累积贡献率为75.675%；第二主成分的特征值是0.721，累积贡献率为12.014%，前两个主成分的累积贡献率为87.69% ＞85%，即占毛大丁草药材中6 种成分信息含量的87.69%，因此可选择其进行评价。第一主成分反映了熊果苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的信息，而第二主成分反映了木犀草苷的信息，见表3～4。

表3 主成分初始特征值和贡献率Tab.3 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表4 相关矩阵Tab.4 Correlation matrices

根据主成分分析结果，对6 种成分的含量进行综合评价，计算主成分得分和综合得分，利用主成分矩阵得到得分系数矩阵，表达式如下。

Prin 1 ＝0.403 1X1+0.442 5X2+0.296 1X3+0.424 2X4+0.422 8X5+0.441 1X6

Prin 2 ＝-0.199 0X1+0.087 1X2+0.892 7X3-0.328 6X4+0.025 9X5-0.215 5X6

由此可知，第一主成分方差贡献率最大，包含最多的信息，最大系数是X2，表明绿原酸含量在质量控制中起到了比较重要的作用。综合评价函数F＝0.756 75F1+0.120 14F2，再计算30 批样品的综合得分和排序，见表5。

4 讨论

本实验分别考察了不同提取溶剂（乙醇、甲醇、30%甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇）、提取方式（超声、回流、索氏）和提取时间（1、2、3 h），结果发现50%甲醇作为溶剂，加热回流提取2 h 效率最高，杂质最少。

分别考察了不同流动相系统，包括甲醇-水、乙腈-水，发现后者分离效果较好。同时考察了不同流动相pH（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%冰醋酸水、乙腈-0.1% 甲酸水）、不同色谱柱、不同体积流量、不同柱温和不同进样量等，最终选择“2.2”项下条件。

表5 主成分得分、综合得分排序Tab.5 Ranks of principal component scores and comprehensive scores

毛大丁草含有多种化学成分，主要有酚酸类、黄酮类等，均具有明显的生物活性［20-23］，本研究发现，6 种成分中熊果苷含量最高，木犀草苷最低，提示熊果苷的含量可作为毛大丁草质量控制的重要指标。聚类分析结果表明不同产地之间各成分含量差异较大，且同一地区药材质量并不统一，可能与不同气候和不同采收期等因素有关。主成分分析结果表明，S11 批样品的综合得分为3.223 9，居首位，同时其绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 等咖啡酰基奎宁酸总含量最高，表明其成分含量较好；而S13 批的综合得分最低，绿原酸等咖啡酰基奎宁酸总含量也最低，提示绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 等咖啡酰基奎宁酸的含量与毛大丁草的品质可能存在相关性，且以绿原酸的含量为主。本研究建立了UHPLC-PDA 含量测定方法，可以同时对毛大丁草中6 种成分进行定量分析，其中熊果苷、绿原酸的含量在毛大丁草药材中占重要地位。