间充质干细胞在宫腔粘连治疗中的作用及机制研究进展

张明乐，黄向华

(河北医科大学第二医院妇科，石家庄 050000)

宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)是严重危害女性生育功能的妇科常见疾病，并且随着宫腔手术的增加呈增长趋势，已成为女性子宫因素不孕的首要病因。IUA的主要原因是子宫内膜基底层受损引起内膜纤维化、子宫壁或宫颈管粘连，临床表现为月经量减少、流产及不孕。IUA的治疗主要是IUA分离术(transcervical resection of adhesion，TCRA)，术后放置物理屏障预防再次粘连，口服雌激素促进子宫内膜修复[1]。轻、中度IUA疗效尚可，但是重度IUA治疗效果欠佳，术后再粘连率高，活产率仅为29.1%[2]。IUA的本质是一种纤维化疾病，间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)是一类多能干细胞，具有自我更新和多向分化能力，其作为新的再生医学方法已成治疗组织损伤以及损伤导致纤维化疾病的热点。

1 MSCs在IUA治疗中的作用

MSCs具有多向分化潜能，已有大量基础研究及临床试验证实其治疗IUA的有效性，主要包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSC)、脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、月经血干细胞(menstrual blood-derived stem cells，MenSC)和羊膜间充质干细胞等。随着对MSCs研究的逐步深入，其旁分泌作用逐渐被重视，外泌体(exosome，EXO)被认为是发挥主要作用的因子[3]。EXO是活细胞分泌的膜性囊泡，直径约30～100nm，内含蛋白质、mRNA、microRNA、IncRNA等，可在细胞间进行物质传递。MSCs来源的外泌体能促进子宫内膜修复[4-5]。MSCs条件培养液含有其分泌的多种活性物质，具有易于获取、使用方便、安全性高等优点，应用MSCs分泌的多效因子或条件培养液能促进子宫内膜再生[6-7]。

1.1 BMSCs BMSCs是一类具有保留体外自我复制能力和多向分化潜能的干细胞，可在体外进行大量扩增，迁移到损伤部位参与组织再生。虽然BMSCs自我更新能力的年龄依赖性和提取过程的有创性限制了其使用，但是BMSCs仍是临床移植最常见的细胞来源，许多研究已经阐明了其在子宫内膜再生中的作用。

Wang等[8]将BMSCs通过鼠尾静脉与宫腔内注射的方式治疗IUA大鼠，结果显示,与对照组相比，两种给药途径都显著增加子宫内膜腺体数量，降低纤维化面积率，上调子宫内膜雌孕激素受体表达。但是也有研究发现，在将干细胞归巢到子宫方面，全身注射优于局部注射；同时观察到BMSCs在受损伤和未受损伤的宫角之间的募集无差异，表明干细胞的归巢广泛发生在子宫内，而不是特定的损伤部位[9]。Yang等[10]将BMSCs与维生素C注射到IUA大鼠宫角，结果证实BMSCs和调节因子维生素C的治疗促进了受损IUA子宫内膜的修复。Xin等[11]研究证实，BMSCs外泌体联合胶原蛋白通过miRNAs的免疫调节功能促进IUA小鼠子宫内膜再生和生育力恢复。

2011年，1例重度IUA患者接受自身骨髓的成体干细胞移植，移植后子宫内膜厚度增加并获得成功妊娠[12]。2014年，6例重度IUA患者接受单核干细胞子宫内膜下移植，移植后5例患者月经恢复[13]。2016年Santamaria等[14]首次将BMSCs用于11例复发性IUA患者和5例子宫内膜萎缩患者的治疗。每例患者平均采集1.24×109个自体BMSCs，通过介入治疗注射到子宫动脉，在移植前后都接受了激素替代疗法。移植后除1例子宫内膜萎缩患者外，所有患者的月经周期均在1个月内恢复，宫腔镜评估期别降低，3例患者自然妊娠，7例患者通过14次胚胎移植而妊娠。

1.2 UC-MSC UC-MSC具有较高的分化潜能，并且具有取材方便、无伦理学争议和免疫原性低等优点，因此越来越受到研究者们关注。Shi等[15]通过体外培养试验证实，UC-MSC能向子宫内膜上皮细胞诱导分化，cAMP/PKA信号通路可能是其分化的关键通路。Zhang等[16]给IUA大鼠鼠尾静脉注射UC-MSC，治疗后大鼠子宫内膜形态与妊娠率均显著改善，纤维化标记物与炎性因子水平显著降低。有研究证实，移植的胶原/UC-MSCs能促进子宫内膜再生和胶原重塑，诱导原位子宫内膜细胞增殖，并增强雌孕激素受体的表达[17]。还有研究证实,UC-MSC来源外泌体能促进IUA大鼠子宫内膜修复[6]。

一项应用UC-MSC治疗IUA的I期临床试验，纳入了26例接受IUA分离术后复粘的女性。受试者在接受IUA分离术后，均在宫腔內放置胶原支架与UC-MSC复合物，治疗后3个月受试者内膜厚度增加，共有10例患者成功妊娠，8例活产，无严重不良反应[18]。

1.3 ADSCs ADSCs与BMSCs具有相似的基因表达谱和分化潜能，但是获取方法较简单,创伤小，增殖能力强。有学者将ADSCs通过子宫注射联合腹腔注射的方式治疗IUA大鼠，结果显示，与单纯IUA组相比，ADSCs治疗组子宫内膜修复明显，但与雌孕激素治疗组效果无明显差异，ADSCs联合雌孕激素治疗组子宫内膜修复效果最佳[19]。Zhao等[5]通过腹腔注射ADSCs来源外泌体治疗IUA大鼠，结果显示其能促进子宫内膜修复与生育能力。

临床研究方面，6例AFS评分为重度IUA，IUA分离术后接受激素替代治疗子宫内膜仍然菲薄的患者接受了自体ADSCs治疗。所有受试者都接受了吸脂术，ADSCs通过宫腔灌注方式应用，治疗后受试者进行雌孕激素序贯治疗。治疗后，受试者内膜平均厚度从3.0mm增加到6.9mm，5例患者的月经情况得以改善，1例患者通过IVF成功妊娠，但是在孕9周时流产[20]。

1.4 MenSC MenSC是子宫内膜MSCs的来源，具有易于获得、无伦理争议、遗传性稳定、增殖能力强、无致瘤性及无免疫原性的优势，是治疗IUA的潜在来源，已在动物模型及临床试验中进行研究。当与TGF-β、17β-雌二醇、PDGF和表皮生长因子共培养时，MenSC能在体外分化为子宫内膜细胞；将其移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠腋窝下能产生子宫内膜组织[21]。Zhang等[22]研究发现，MenSC能修复子宫内膜，其条件培养液通过Akt和(或)ERK信号通路在子宫内膜修复的过程中促进血管生成。

我国学者纳入7例(20～40岁)有月经合并有不孕的重度IUA患者(III～IV级)进行临床研究。收集2周的月经血，将自体MenSC进行分离培养后移植回子宫，移植后给予激素替代治疗。结果显示5例受试者内膜厚度增加到7mm，4例患者接受了IVF-ET，其中2例成功妊娠，1例自然流产[23]。

此外还有关于羊膜MSCs治疗IUA的基础研究[7，24]，以及胎盘干细胞进行组织修复的相关研究[25-26]，这些干细胞也许也是未来治疗IUA的选择。

2 MSCs治疗IUA的作用机制

MSCs促进子宫内膜修复是其分化功能还是分泌功能发挥主要作用,目前尚无定论，但是越来越多的研究支持分泌作用在组织损伤修复中发挥主要功能。MSCs治疗IUA，促进子宫内膜再生的可能机制有：(1)干细胞归巢后分化为新组织细胞；(2)抑制上皮间质转化，抑制纤维化进程；(3)调控局部的MSCs增殖、迁移，促进子宫内膜再生；(4)通过释放免疫调节因子，影响血管生成；(5)通过上调抗炎细胞因子和下调促炎细胞因子发挥免疫调节作用[27-28]。

2.1 干细胞归巢后分化为新组织细胞 Taylor[29]在接受骨髓移植女性的子宫内膜内发现,供者的BMDSCs可分化成为子宫内膜细胞。有研究证实,循环血中低水平BMDSCs可整合至损伤部位分化成为包括子宫内膜在内的相应组织细胞[30]。有学者通过外源性因素或内源性间质细胞分泌因子等在体外培养条件下成功将BMDSCs、UC-MSC诱导分化为子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells，EECs)[31-32]。Cong等[33]将BMDSCs与EECs联合共培养，利用蛋白质组学分析BMDSCs向EECs转化过程中的差异蛋白及其相关途径，发现ERK/MAPK以及α-catenin通过调节细胞间信号传导、组织发育和细胞运动网络中的核心差异蛋白发挥重要作用。上述研究均表明干细胞归巢后可分化为新的组织细胞。2007年Mints等[34]在1例接受男性亲属骨髓移植的血液病女性患者剖宫产术后取得的子宫内膜中发现，平均14%的子宫内膜血管内皮细胞为供者来源；1年后对其再次行子宫内膜活检术，发现仅有10%的子宫内膜血管内皮细胞为供者来源。表明BMDSCs是一个诱导子宫内膜细胞再生的有限来源，而不是子宫内膜干细胞的循环来源，这与Cervello等[35]的观点一致。

2.2 干细胞抑制上皮间质转化、抑制纤维化进程 IUA本质是一种纤维化疾病，即子宫内膜严重损伤修复造成胶原纤维沉积在宫腔内而造成内膜纤维化。目前有多项研究表明，IUA发生与TGF-β/Smad3通路相关[36-38]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮性细胞经过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物过程，在创伤导致的纤维化疾病的发生发展中II型EMT具有重要作用[39]。已有研究提示,Smad信号与EMT和子宫内膜纤维化过程相关[28]。因此MSCs可能通过抑制TGF-β/Smad3信号通路，抑制EMT与子宫内膜纤维化，从而促进子宫内膜修复。

2.3 调控局部的MSCs增殖、迁移及促进子宫内膜再生 女性一生大约要经历400多个周期子宫内膜脱落与再生，其强大再生能力被认为与子宫内膜干细胞相关[40]。2004年，Chan等[41]首次从子宫内膜中分离出子宫内膜干细胞(endometrial stem cells，EnSCs)。EnSCs是包括子宫内膜间充质干细胞(endometrial mesenchymal stem cells，EMSCs)、子宫内膜上皮干细胞(endometrial epithelial stem cells，EESCs)、子宫内膜侧群细胞(endometrial side population，ESP)以及子宫内膜再生细胞(endometrial regenerative cell，ERC)等多种细胞分化的来源。当内膜损伤后原位的干细胞可被激活并进行子宫内膜的修复[42]。MSCs可能通过调节和激活局部的EMSCs，促进子宫内膜再生。

2.4 通过释放免疫调节因子影响血管生成 新生血管形成对内膜的再生与修复起重要作用，血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)具有促进内皮细胞分裂和维持血管通透性等重要作用。VEGF在月经后内膜的修复再生早期起重要作用，可快速促进血管生成。子宫血流量低和血管生成受损被认为是子宫内膜变薄的原因[43]，然而子宫内膜损伤会导致VEGF高表达[44]，促使新生血管发生，血管通透性增加，血管中纤维蛋白原渗出并诱导成纤维细胞积聚，子宫内膜被纤维结缔组织替代，导致IUA。MSCs可能在IUA产生的不同阶段通过调控VEGF影响血管生成，促进子宫内膜修复。

2.5 通过上调抗炎细胞因子和下调促炎细胞因子发挥免疫调节作用 有研究认为，子宫内膜脱落与再生与孕激素撤退触发宫腔内一系列炎症细胞及其介质反应相关[45]。通过收集月经不同时间点内膜检测炎症因子表达水平，发现不同时间点表达水平不同，表明炎症反应在内膜损伤修复中发挥重要作用[46]。过度炎性反应会导致子宫内膜异常修复，发生纤维化[47]，但是炎症细胞和介质对纤维化过程的调控尚无系统研究。MSCs可能产生上调抗炎细胞因子(如IL-2、IL-4、IL-10)和下调促炎细胞因子(如IL-17和肿瘤坏死因子α)发挥子宫内膜的修复作用[27]。

外泌体被认为是在MSCs分泌功能中发挥重要作用的因子，其包含的多种RNA分子在细胞之间进行信号传递，发挥生物学效应。Xiao等[48]研究表明，miR-340参与调控BMCSs治疗子宫内膜修复的过程，外泌体介导了miR-340从BMCSs向子宫内膜间质细胞的传递。一项关于系统性硬化症的研究发现，其成纤维细胞外泌体中胶原相关miRNA水平失衡，表明在系统性硬化症中外泌体数目和含量都发生了变化[49]。Li等[50]证实miR-29b通过阻断Sp1-TGF-b1/Smad-CTGF途径抑制子宫内膜纤维化。这些研究中抗纤维化miRNA可作为未来治疗宫腔粘连的靶点。有学者通过腹腔注射与子宫肌层局部注射途径利用MSCs-EXO治疗宫腔粘连，取得了满意结果[4-5]，但是外泌体临床应用的途径还需更多的研究来探讨。

3 总结与展望

随着MSCs治疗的不断进展，研究发现使用来自骨髓、脐带血、脂肪和月经血的MSCs可帮助子宫内膜再生，为中、重度IUA患者带来了希望。尽管在MSCs治疗IUA研究领域已获得了很多进展，但是仍存在许多问题。如在子宫内膜修复领域，胚胎干细胞可能与子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位症和子宫腺肌病等的发生有关，MSCs是否会产生相同的问题?另一个问题是干细胞除了参与增殖外，还通过分泌生长因子刺激血管生成，加速纤维结缔组织形成。

明确MSCs治疗IUA的作用机制具有重要意义，不仅能为临床应用提供理论依据，提高应用过程中的安全性，更为临床转化指明方向。若MSCs的作用以分化功能为主，临床转化研究将集中于MSCs的安全性、应用途径与剂量；若以分泌功能为主，未来的研究方向将集中于MSCs外泌体与干细胞多效因子的提取，及其相关生物产品的制备。

MSCs治疗IUA的最佳应用途径尚无定论，文献报道的应用途径有子宫内膜下移植[13]、经子宫动脉注射[14]、联合胶原支架宫腔内放置[18]以及宫腔灌注[20]。从临床应用角度，宫腔内放置MSCs缓释途径可能最便捷，但是如何保持MSCs活性、其宫腔内作用时间和评估治疗效果仍需进一步研究。已有研究表明，生物材料，如胶原支架、水凝胶和纳米结构脂质载体等可提高移植细胞存活率，促进干细胞/多效因子的递送，因此这些新型生物材料可改善细胞治疗的结果。将MSCs种植到生物材料表面或内部，同时放置到宫腔内治疗宫腔粘连的研究已有成功的报道[18,51-52]，MSCs联合生物材料的模式也是未来IUA的治疗研究的一个重要方向。