常见淡水鱼肉制品快速鉴别方法的建立

2021-03-05张林周剑光喻亚丽何力

中国渔业质量与标准 2021年1期

张林，周剑光，喻亚丽，何力

(农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心，中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北武汉 4300223)

中国是水产品生产大国，也是水产品加工、出口大国，水产品及其加工品在中国经济与对外贸易中均占有举足轻重的地位。特别是由四大家鱼加工制备的鱼肉制品(鱼片、鱼丸、鱼糕和鱼排等)的消费量逐年增大，在超市、餐厅广受消费者青睐。由于制备鱼肉制品的鱼肉种类及组成不同，其营养价值及品质等方面存在较大的差异，而鱼肉制品经过加工，已经不能从外观等形态学特征鉴定组成鱼肉的鱼类品种，因此有不法商家以低值品种鱼假冒高值品种鱼制备鱼肉制品。近年来中国鱼肉制品的标签存在标识错误的现象，不法商贩为追求利润存在以次充好的现象，如以油鱼(Pseudogyrincheilusprocheilus)冒充鳕(Gadus)[1]，或掺入廉价鱼肉品种等现象，这些现象容易造成无法针对所生产的鱼肉制品采取有效的保藏措施，进而引发更多的问题，如鱼肉制品老化、劣化等，对后续的鱼糜制品生产造成严重的影响。此外，这种掺假行为严重扰乱了行业正常秩序，侵犯了消费者的知情权，对消费者的利益造成损害，甚至造成食品安全隐患[2]。目前，对于青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthysnobilis)4种鱼肉制品的快速检测方法还未有相关报道。为了维护鱼肉制品尤其是鱼糜产业的健康发展，保护消费者的合法权益，杜绝不安全食品流向餐桌，急需针对四大家鱼鱼肉制品建立一种能够快速、准确、高效地鉴定区分鱼肉制品成分的快速检测方法。因此本研究通过对已报道的四大家鱼序列进行比对分析，筛选青鱼、草鱼、鲢和鳙四大家鱼特异基因序列，设计了4对特异性引物，采用多重PCR的方法[3-4]，运用基因克隆技术和生物信息学技术，建立同时针对青鱼、草鱼、鲢和鳙的准确、快速且高效的多重PCR检测方法，以期为安全的鱼肉制品市场监管提供技术支持，为广大消费者提供食用安全保障。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的70个四大家鱼鱼肉样品为本地市场上随机抽取，包括冷冻鱼10个、鱼排15个、鱼丸15个、鱼糕15个和烤鱼片15个。将冷冻鱼、鱼排、鱼丸和鱼糕置于-20 ℃冰箱保存备用，烤鱼片置于常温条件下备用。品种明确的青鱼、草鱼、鲢和鳙鲜活鱼均由长江水产研究所养殖场提供。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs (2.5 mmol/L)。100 bp DNA ladder、pMD-18T载体及Top10感受态细胞均购自Takara公司。Tris-平衡酚(pH 8.0)、无水乙醇等化学试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。蛋白酶K购自德国Sigma公司。

1.3 仪器与设备

3K15冷冻离心机(德国Sigma公司)；PCR仪(Thermofisher公司)；DYCP-31E电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(Bio Rad公司)和Nanodrop微量核酸蛋白测定仪(Thermofisher公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 鱼肉制品DNA提取

鱼肉组织DNA的提取采用传统的苯酚/氯仿方法[5]。取30 mg捣碎的鱼肉样品，向其中加入600 μL含有蛋白酶K(终质量浓度为200 μg/mL)的组织裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.5% SDS，pH 8.0)，充分混匀，于55 ℃水浴锅裂解至澄清，加入600 μL由苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1，V/V)组成的抽提液进行抽提，上下翻转3～5次混匀后，12 000 r/min。离心10 min，取上清至新的离心管中，再次加入600 μL氯仿进行二次抽提，上下翻转3～5次混匀，12 000 r/min离心10 min。再次取上清至新的离心管中，加入700 μL冰乙醇静置2～3 min，5 000 r/min离心3 min，弃去上清液，收集沉淀DNA。用70%乙醇清洗沉淀2次，室温下晾干；加入50 μL无菌水溶解DNA，-30 ℃储存备用。

1.4.2 样品DNA纯度及质量浓度的测定

吸取经10倍稀释后的DNA溶液2 μL，以去离子水作为空白对照，使用微量核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度及纯度。

1.5 扩增的目的基因及引物设计

NCBI网站下载青鱼D-LOOP基因、草鱼的COI基因、鲢16SrRNA基因和鳙12SrRNA基因序列，通过DNAstar 5.0软件中的Megalign进行比对分析，根据每种基因的特异性保守序列，设计4对特异性引物(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 目的基因名称及引物序列Tab.1 Target gene and primer sequence

1.6 目的片段的PCR扩增及特异性分析

先用已知的4种鱼肉制品进行单一扩增，扩增体系为：10×Taq酶buffer(含Mg2+)2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)，模板DNA 2 μL以及Taq酶0.3 μL(5 U/μL)，并用去离子水补至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，并对目的条带进行回收，将回收产物分别克隆至pMD18T载体，构建重组质粒，并将重组质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，并对测序结果进行比对分析。

1.7 单管多重PCR的优化

为优化多重PCR的最佳反应条件，对引物浓度、模板量、MgCl2浓度和退火温度进行了摸索，引物浓度初步确定(A1:0.3、A2:0.5、A3:1 μmol/L)，模板量(B1:0.05、B2:0.5、B3:50 pg)、MgCl2浓度(D1:1、D2:1.5、D3:2 mmol/L)和退火温度(C1:50、C2:55、C3:60 ℃)，采取固定其他因子，改变某一因子的方式，设计L9(34)正交试验，确定最佳反应条件，分别对4种鱼肉制品进行检测，正交试验表见表2。多重PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳，观察产物条带。

表2 L9(34)正交试验Tab.2 L9 (34) orthogonal test programs

1.8 多重PCR特异性测定和敏感性测定

1.8.1 多重PCR 特异性测定

分别以4种含有不同鱼的目的基因片段的单一质粒为模板，同时加入4对引物进行扩增；另外，将含有不同鱼的目的基因片段的重组质粒进行随机组合，同时加入4对引物进行扩增，验证多重PCR扩增的特异性。

1.8.2 多重PCR敏感性测定

以经过连续稀释(1∶10)含有不同鱼目的基因的质粒为模板，按已优化的多重PCR反应条件分别进行扩增，测定多重PCR的灵敏性及目的基因的最低检测浓度。

1.9 人工模拟样品的检测和市售食品的验证

将4种鱼肉制品制成鱼糜，将其中任意2种、3种或4种混合，制成人工模拟鱼糜混合样品，每种鱼糜成分不低于2%；将市场上采集的不同品种鱼片、鱼丸、鱼糕和鱼排各15份，冷冻鱼10份(共70份)，在4 ℃冰箱里贮藏2 d，然后无菌操作取样品各25 g均质成鱼糜样品；将所有的鱼糜样品各取1 g，提取鱼糜样品DNA，进行多重PCR检测，同时用常规方法和单一PCR检测，以验证建立的多重 PCR 检测方法的可行性与准确性。

2 结果

2.1 单一PCR扩增和核苷酸序列分析

用所设计的特异性引物扩增，PCR产物经过凝胶电泳分析得到青鱼、草鱼、鲢和鳙的目的片段，大小分别为298、210、306和639 bp，大小与预期相符。经克隆测序分析，所扩增目的片段与GenBank中相应基因序列同源性为98.1%～99.5%。

图1 单重PCR扩增4种鱼肉制品电泳结果1：青鱼；2：草鱼；3：鲢；4：鳙；M：100 bp DNA ladderFig.1 Electrophoresis results of single PCR for 4 fish products1: M.piceu；2: C. idella；3: H. molitrix；4: H. nobilis；M: 100 bp DNA ladder

2.2 多重PCR的优化结果

经过L9(34)正交试验对引物浓度、模板量、MgCl2浓度和退火温度4个条件进行了摸索，对多重PCR的最佳反应条件进行了优化，结果表明，优化后的反应体系为：在25 μL的反应体系中， MgCl2为 1.5 mmol/L，模板质粒为 4 μL(青鱼、草鱼、鲢和鳙各1 μL)，上下游引物3.2 μL(青鱼各0.5μL、草鱼各0.5 μL、鲢各0.3μL和鳙各0.3 μL)，dNTPs 2.5 μL(2.5 mmol/L)，Taq酶0.5 μL(5 U/μL)，10×Taq酶buffer 2.5 μL，PCR退火温度为55 ℃，35个循环。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

2.3 多重PCR的特异性

当不同组合的4种鱼肉制品进行多重PCR时，都可以扩增出各自的目的基因片段，并且能通过琼脂糖凝胶电泳鉴定区分开来(图2～图5)。阴性对照均无扩增产物。

图2 青鱼单重PCR及多重PCR扩增不同鱼肉组合电泳图1：青鱼；2：草鱼+鳙；3：青鱼+鳙；4：鲢+鳙；M：100 bp DNA ladderFig.2 Electrophoresis results of single PCR for M. piceu and multiple PCR for different fish combined1: M.piceu；2: C. idella+ H. nobilis；3: M.piceu+ H. nobilis；4: H. molitrix+ H. nobilis; M.100 bp DNA ladder

图3 草鱼单重PCR及多重PCR扩增不同鱼肉组合电泳图M：100 bp DNA ladder；1：草鱼+青鱼；2：青鱼+鲢；3：草鱼+鳙；4：草鱼+鲢；5：草鱼；6：阴性对照Fig.3 Electrophoresis results of single PCR for C. idella and multiple PCR for different fish combinedM:100 bp DNA ladder; 1:C.idella+M.piceu；2: M.piceu+H.molitrix；3:C.idella+H.nobilis；4:C.idella+H.molitrix；5: C.idella；6:negative control

图5 多重PCR扩增不同鱼肉组合电泳图1：青鱼+草鱼+鲢+鳙；2：青鱼+草鱼+鳙；3：青鱼+草鱼+鲢；M：100 bp DNA ladderFig.5 Electrophoresis results of multiple PCR for different fish combined1: M.piceu+C. idella+ H. molitrix+ H. nobilis；2: M.piceu+C. idella+ H. nobilis M.piceu；3: M.piceu+C. idella+ H. molitrix

2.4 多重PCR检测灵敏度

对含有目标片段的青鱼、草鱼、鲢和鳙重组质粒的多重PCR检测，灵敏度分别是0.5、50.0、50.0和0.5 pg；而单重PCR检测灵敏度分别是0.5、0.5、0.5和0.05 pg，结果表明多重PCR具有和单重PCR存在部分片段具有相同灵敏度。

2.5 人工模拟试验和市售食品验证结果

运用优化后的多重PCR反应对70份人工模拟样品进行鉴定，都能够扩增出各自相应的特异性条带，无非特异性扩增。表明该方法能够区分出由4种鱼肉随机组合的人工模拟鱼糜样品中所混合的成分，有效地识别鱼糜产品中青鱼、草鱼、鲢和鳙4种鱼肉的组成。

用该方法对随机采集的60份市售鱼肉样品进行检测，结果为22份鲢阳性样品、20份草鱼阳性样品、5份青鱼阳性样品和5份鳙阳性样品，其中5份同时检测出草鱼和白鲢，2份同时检测出青鱼、草鱼和鲢，1份同时检测出鲢和鳙。检测结果与单一PCR和常规方法检测结果一致，3种方法的符合率达100%，表明该多重PCR检测方法结果准确可靠。

3 讨论

3.1 DNA提取方法的选择

DNA的提取主要包括：CTAB法、SDS法、苯酚/氯仿法、试剂盒法及高盐法等[6]。通过所得DNA的浓度和纯度的比较，对各提取方法进行评价，并采用特异性引物扩增检验所得DNA模板质量。结果表明，采用试剂盒法和苯酚/氯仿法提取DNA浓度较高，纯度较好，均能满足PCR鉴别实验。相比而言，试剂盒方法更简便，但是对于大量样品而言，成本较高，而苯酚/氯仿法为经典的提取方法，操作简单，所需仪器设备均为实验室常规设备，便于实验室采用。因此，本实验选择苯酚/氯仿法进行样品DNA提取。

3.2 目的片段的选择

扩增目的基因的选择对PCR的特异性非常重要。实验所需的目的基因既要满足能够鉴定样品中是否含有青鱼、草鱼、鲢和鳙样品，同时还要区分样品中青鱼、草鱼、鲢和鳙4种鱼的成分。所以理想的目的基因是在同种鱼类中相对保守的基因，又可以区分4种鱼的差异基因。线粒体基因一方面保守性高，能够利用通用引物进行大范围扩增；另一方面有足够的变异趋势来区分不同物种DNA序列，从而对不同物种进行鉴定。因此线粒体基因常用来作为鉴定不同物种的有效目的基因。

线粒体DNA是线粒体基质中含有的全部环状DNA分子。线粒体DNA不含间隔区与内含子，无重复序列，无不等交换，无基因重组、倒位和易位等畸变[7]。因此，线粒体DNA在分子进化研究中作为常用的工具，通过比较不同物种相同基因之间的差别，确定这些物种在进化上的亲缘关系。线粒体16SrRNA、12SrRNA、COI、D-LOOP和Cytb基因在鱼类种内具有较高的同源性，而在不同种间的多态性差异比较明显，表明这些基因适于进行鱼类种以上阶元的鉴定[8]。

本研究从实验的准确性和适用性角度出发，在保证方法灵敏度满足检测需要的前提下，进行鉴定方法的选择，确定运用多重PCR检测。在确定使用分子生物学鉴定方法的前提下，通过NCBI上序列比对，避免4种鱼所选基因序列有相同序列，最后选取了线粒体青鱼D-LOOP部分序列、草鱼COI部分序列、鲢16SrRNA部分序列和鳙12SrRNA部分序列。通过比较发现所选4种鱼部分序列无交叉重叠序列，能够进行明确的物种鉴定。

3.3 鉴定方法的优化

本研究尝试运用多重PCR定性检测四大家鱼鱼肉制品中青鱼、草鱼、鲢和鳙的成分，为实现这一目标，首先通过引物优化设计排除PCR扩增时可能发生的错配，避免4对引物间形成黏性末端或部分双链。

另外，考虑到多重PCR的结果受多因素影响，如不同引物之间的竞争、模板和引物的浓度及其相对比例、dNTP浓度、Tm值及Mg2+浓度等[9-10]，本实验在验证所设计引物为特异性扩增的基础上，通过正交设计对引物浓度、Tm值、Mg2+浓度和模板量等4个条件的多种组合进行最佳PCR条件的摸索。同时对退火温度PCR反应条件进行梯度优化实验，最终得到鱼糜制品成分检测的最适PCR体系和反应条件。

3.4 合理的引物设计

目前，还没有利用多重PCR方法检测青鱼、草鱼、鲢和鳙4种鱼肉的研究报道。在本实验中，多重PCR可成功检测这4种主要的鱼肉制品。在多重PCR中，合理的引物设计和引物对的适当比例是扩增成功的关键[11]。针对青鱼、草鱼、鲢和鳙的特异性引物，均能扩增出各自的特异性基因片段，而对其他3种鱼类没有扩增出来，表明所设计的引物是特异的。在多重PCR中，同时扩增多个目的片段，1种引物可能优先其他引物而扩增[12-13]。本实验通过调整4种鱼肉制品的引物比例，成功扩增到目的条带。利用多个引物设计的多重PCR方法，存在灵敏度不高的问题。本实验通过优化反应条件，灵敏度明显提高。尽管4对引物被混合在PCR反应中，依然能够通过多重PCR有效地检测出这4种鱼类。在以前报道中，多重PCR的灵敏度与单重PCR相同或低10倍[14]。然而，本研究所建立的多重PCR体系的灵敏度与单重PCR相比，具有相同或低10～100倍灵敏度，这一结果与姜永厚等[15]结果类似，分析原因可能为体系中的引物、模板种类和数量增加，增加了模板和引物结合的概率[16]。本实验对多重PCR作为传统PCR的补充进行了评价。针对上述4种鱼肉制品的110个样本进行了检测，多重PCR与单一PCR检测结果基本一致。目前，很多超市、菜市场或餐厅的鱼肉制品中存在混杂现象，如青鱼鱼丸、鱼糕或鱼排中混有草鱼；鲢或草鱼糕中掺杂其他鱼肉[17]；鳙鱼头火锅中掺杂白鲢鱼肉[18]。

多重PCR在检测和确定鱼肉制品具有一种或多种鱼种方面，具有省时、省力、费用低的优点。本实验建立的多重PCR检测方法可用于水产品成分的鉴定。