白藜芦醇对脂多糖诱导草鱼肾脏细胞炎症的抑制作用

陈凯，谭宏亮，习丙文，谢骏*，潘良坤

(1.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室；2.南京农业大学无锡渔业学院：江苏 无锡 214081)

随着社会对水产品质量安全的日益关注和水产养殖的提质增效，传统渔病的防治措施正面临着限抗、减抗及禁抗的严格限制，因此，替代传统渔病防治药物的新型绿色渔药研发备受关注[1]。中草药具有悠久的历史，现代药理学研究证实中草药中的有效成分在抗菌[2]、促进机体免疫[3]和缓解病理损伤[4-5]等方面具有良好的表现，其有效成分在新型绿色渔药开发和渔病防治方面具有广阔的应用前景。

白黎芦醇(resveratrol)是一种非黄酮类多酚类化合物，广泛存在于葡萄、蓝莓和虎杖等植物中，具有抑菌[6]和抗病毒活性[7]功能，并且在清除自由基[8]、提高动物机体抗氧化性能[9-10]及降低炎症反应[11-12]等方面也具有显著功效。近年来，利用白藜芦醇改善水产动物日粮缺陷，调节养殖鱼类代谢、免疫、炎症反应以及提高机体抗逆性和水产品质量方面的研究报道日益增多。如：改善高脂日粮诱导的团头鲂(Megalobramaamblycephala)[13]代谢紊乱；缓解豆粕替代鱼粉引起大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[14]肝脏抗氧化功能损伤和肠道炎症等。目前关于白藜芦醇对水产动物的促生长作用尚存在争议，Menoyo等[15]在大西洋鲑(Salmosalar)的研究中发现白藜芦醇对实验动物的摄食和生长有抑制现象，但Wilson等[16]却发现白藜芦醇能通过限制蛋白质损伤，降低蛋白质降解率，促进牙鲆(Paralichthysolivaceus)生长。关于白藜芦醇提高鱼类抗氧化能力的作用已被广泛接受，白藜芦醇有效改善鱼体抗氧化能力的结论已在团头鲂[13]、大菱鲆[14]及牙鲆[16]等鱼类中相继被证实。此外，学者们利用细胞学技术对白藜芦醇在免疫和炎症调控方面的潜力也进行了大量探索性研究，如利用虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[17]、大西洋鲑[18-19]和大菱鲆[20]等鱼类细胞开展的体外研究结果均表明白藜芦醇具有调节鱼类免疫和炎症的潜力，Leiro等[20]在其研究中指出了白藜芦醇的抗炎作用可能和阻断TNF-αmRNA的成熟相关。但目前利用细胞学技术对白藜芦醇在免疫和炎症相关方面开展的研究主要集中在海水鱼类上，淡水鱼类方面的研究报道较少。

本研究在利用草鱼(Ctenopharyngodonidella)肾脏细胞构建LPS细胞损伤模型的基础上，通过白藜芦醇干预，利用检测细胞存活率、细胞损伤以及抗氧化指标分析抗氧化酶基因和炎症基因的表达，评价白藜芦醇对脂多糖诱导的草鱼肾脏细胞损伤的保护作用，以期丰富白藜芦醇在水产动物疾病防控应用中的基础数据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

Medium199培养基(Hlyclone)、胎牛血清(Gibco)及白藜芦醇(99%)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脂多糖(LPS)、胰蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购于碧云天生物技术有限公司；细胞MTT试剂盒和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及乳酸脱氢酶(LDH)等测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、One Step SYBR®PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 细胞培养与实验设计

草鱼肾脏细胞系(grass carp kidney cell，CIK)由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员实验室馈赠；使用完全培养基(含10%胎牛血清的Medium199培养基)，于二氧化碳恒温培养箱(28 ℃，5% CO2)内培养。

选取对数生长期的CIK细胞用胰蛋白酶消化并制备单细胞悬液，使用完全培养基调整细胞浓度至5×105cells/mL，按2 mL/孔均匀接种于12孔细胞培养板中，置于28 ℃，5% CO2培养箱中培养。

培养2 h待细胞贴壁后，LPS对照组在完全培养基中加入1 μg/mL LPS，白藜芦醇处理组更换含1 μg/mL LPS和不同浓度白藜芦醇的完全培养基(白藜芦醇应用液用DMSO配制，按照1%添加到完全培养基中，终浓度分别为2 μg/mL和4 μg/mL)，空白对照组用含等量溶剂的完全培养基替代。继续培养12 h后，根据后续实验要求采集、处理和保存培养液及细胞样品。本实验中所采用的白藜芦醇添加量以及DMSO添加量经预实验验证，不影响细胞活性；每组分别设置5个平行。

1.3 LDH与细胞存活率测定

按照1.2中试验设计对细胞进行处理，12 h后收集培养液(不含细胞)，根据LDH试剂盒说明检测培养液中LDH活性。使用PBS小心清洗贴壁细胞3次，按照MTT试剂盒说明书，检测细胞存活率。根据下列式(1)计算存活率：

细胞存活率(%)

式(1)

1.4 抗氧化能力测定

按照1.2中试验设计对细胞进行处理，12 h后弃去培养液，PBS清洗后，使用胰蛋白酶消化收集细胞，用生理盐水洗涤3次后，加入等量生理盐水重悬。按-20 ℃，20 min； 27 ℃，10 min；冻融细胞3次后，4 000 r/min，离心10 min，收集上清，4 ℃暂存备用。随即使用试剂盒检测CAT、SOD、GSH等指标。

1.5 实时荧光定量PCR

按照1.2中试验设计对细胞进行处理，12 h后弃去培养液，PBS清洗后，使用胰蛋白酶消化收集细胞，转移至2 mL 离心管内。每管加入1 mL Trizol，吹打混匀，冰上静置10 min。按照RNAiso Plus试剂盒说明书提取并纯化样品RNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000测定RNA质量和浓度，选取OD260/OD280值在1.8～2.0的样品。最终以40 ng/μL RNA终浓度作为模板，按照Ons Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒说明，配置反应体系、设置反应参数，在ABI PRISM 7500 Real-time PCR System上进行荧光定量PCR反应。每个待测样本进行目的基因和内参基因(β-actin)扩增，设置3个计数重复，每次反应设置阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。所用引物列于表1。所有引物合成，均由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

1.6 数据统计分析

所有实验数据以平均值±标准差(mean ± SD)表示，采用SPSS 20.0软件进行数据正态分布及方差同质性检验，并使用单因素方差分析(one-way ANOVA)中的Duncan’s多重比较进行差异显著性分析，显著性水平设置为P<0.05。

2 结果分析

2.1 白藜芦醇对CIK细胞的保护作用

如图1所示，LPS作用于CIK细胞12 h后，细胞存活率下降为对照组的54.43%，表明1 μg/mL的LPS对CIK细胞具有明显的毒性；而同时给予白藜芦醇时，细胞存活率与LPS对照组相比具有明显提高(P<0.05)，但不同白藜芦醇剂量处理无统计学差异(P>0.05)。结果表明白藜芦醇处理可以在一定程度上保护细胞免于LPS的损伤。

表1 荧光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for quantitative PCR

乳酸脱氢酶(LDH)属于胞内代谢酶，在正常情况下细胞外液中LDH的含量低，因此细胞外液中LDH的活性可以反映细胞的损伤情况。在该研究中发现(图1)，LPS作用于CIK细胞12 h后，细胞外LDH活性显著升高(P<0.05)，由此表明LPS对CIK细胞具有损伤作用。而在给予2 μg/mL白藜芦醇干预时，LDH活性与LPS对照组相比显著降低(P<0.05)；当白藜芦醇的浓度达到4 μg/mL时，LDH活性进一步降低，与对照组相比无显著差异(P>0.05)；由此显示白藜芦醇对LPS造成的相关损伤具有干预作用且存在剂量依赖关系。

图1 白藜芦醇对LPS处理CIK细胞活性的影响图中大写字母表示序号，不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，横坐标中“+”表示使用LPS处理，“-”表示不使用LPS处理。下同Fig.1 Effects of resveratrol on the activity of CIK cells treated with LPSCapital letters indicate serial numbers, different lowercase letters indicate significant differences between groups (P<0.05), "+" means LPS treatment, and "-" means no LPS treatment. The same below.

2.2 白藜芦醇对CIK细胞抗氧化能力的影响

如图2所示，LPS作用于CIK细胞12 h后，与空白对照组相比，细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(CAT)活性都明显下降(P<0.05)，细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量也显著降低(P<0.05)，并且出现了严重的脂质过氧化现象，丙二醛(MDA)水平急剧升高(P<0.05)，表明LPS处理对CIK细胞造成了严重的氧化损伤。而在白藜芦醇的干预下，细胞内SOD活性及GSH含量得以维持在空白对照组水平(4 μg/mL,P>0.05)；CAT活性也显著高于LPS处理组(P<0.05)，与对照组处于同一水平(P>0.05)；脂质过氧化的情况明显改善，MDA水平显著降低(P<0.05)，并且呈现出剂量依赖的关系，白藜芦醇的浓度为4 μg/mL时，MDA水平与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。由此可见，白藜芦醇能有效地减弱LPS造成的抗氧化系统破坏。

图2 白藜芦醇对LPS诱导的CIK细胞抗氧化能力的影响Fig.2 EffectS of resveratrol on the antioxidant capacity of CIK cells treated with LPS

2.3 白藜芦醇对CIK细胞抗氧化酶相关基因转录水平的影响

如图3所示，LPS作用于CIK细胞12 h后，与空白对照组相比LPS处理并未引起SOD基因转录水平的显著变化(P>0.05)，并且在白藜芦醇的干预下，仍未观察到SOD基因在转录水平上的显著变化(P>0.05)，可见白藜芦醇对于LPS所致的氧化损伤干预并非通过调节SOD基因转录水平所实现。

不同于SOD基因的转录表现，CAT基因的转录水平在LPS处理之后就发生了上调(P<0.05)。而CAT基因在白藜芦醇的干预下，其转录水平较LPS处理情况下进一步提高(P<0.05)。

2.4 白藜芦醇对CIK细胞炎症相关基因转录水平的影响

如图4所示，LPS作用于CIK细胞12 h后，与空白对照组相比TNF-α、IFN-γ、IL-1基因的转录水平均出现了显著上调(P<0.05)，而在白藜芦醇(4 μg/mL)的干预下，其转录水平得以恢复到空白对照组水平(P>0.05)，其中TNF-α基因的转录表达在白藜芦醇浓度为2 μg/mL时恢复到了空白对照组水平(P>0.05)，而IFN-γ和IL-1基因的转录水平仅在白藜芦醇浓度为4 μg/mL时观察到显著下调并恢复到空白对照组水平(P>0.05)。IL-10基因与上述基因的表达变化趋势相似，但是各处理组间的表达水平无显著差异(P>0.05)。

图3 白藜芦醇对LPS诱导的CIK细胞抗氧化酶相关基因mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of resveratrol on the mRNA expression of antioxidant enzyme related genes in CIK cells treated with LPS

图4 白藜芦醇对CIK细胞炎症相关基因mRNA表达水平的影响Fig.4 Effects of resveratrol on the mRNA expression of inflammation-related genes in CIK cells treated with LPS

3 讨论

3.1 白藜芦醇对LPS诱导的CIK细胞损伤的干预

通常情况下，体内自由基水平被机体抗氧化系统维持在正常的生理水平。相关过程主要包括SOD参与的超氧阴离子的歧化反应以及过氧化物酶类参与的过氧化物分解[21]。因此，SOD、CAT活性以及GSH含量常常用于反映出机体的抗氧化能力。在本研究中MDA水平显著降低表明白藜芦醇能有效地减少由LPS造成的CIK细胞氧化损伤，这可能得益于白藜芦醇对SOD、CAT活性的维持以及对GSH消耗的减少。目前在哮喘[22]、肠缺血再灌注[23]、铜中毒[24]等疾病相关研究中均显示白藜芦醇能有效地改善氧化损伤，并且与本研究中的结果一致，在白藜芦醇存在的情况下，SOD酶活性得以维持在高水平。白藜芦醇分子结构中的酚羟基和二苯乙烯结构能有效抑制自由基引发氧化反应[25]，因而白藜芦醇在不影响SOD基因表达的情况下，减少SOD蛋白的损耗，从而维持SOD活性。而对于CAT活性的维系则得益于白藜芦醇对CAT基因表达的上调。因此本研究认同白藜芦醇的干预机体或组织细胞氧化损伤的功效主要得益于其对抗氧化物质功能的维系。

目前，有学者认为白藜芦醇通过多途径增加抗氧化酶类表达，发挥其抗氧化作用。因此，为了进一步揭示白藜芦醇对CIK细胞抗氧化能力的调节机制，本研究检测了抗氧化酶相关基因转录表达情况。Jia等[26]在研究罗非鱼(Oreochromsmossambcus)肝脏氧化损伤中提出白藜芦醇经由Nrf2信号通路广泛促进抗氧化物质表达，进而调控细胞氧化应激，该结果与本研究存在一定的差异。本研究只检测到了CAT基因转录水平的上调，而SOD基因的转录表达在不同处理间无显著差异。相似的现象在阿萨[27]的研究中也有观察到。虽然白藜芦醇能提高SOD的活性，但对HEK293T细胞SOD蛋白水平的表达无显著影响。这种差异的出现可能与物种或者细胞种类相关。阿萨研究的不同细胞株经白藜芦醇处理后，在抗氧化酶活性以及酶蛋白表达水平上就呈现出不同变化[27]。此外，针对本研究中出现的SOD基因在转录水平上相对稳定，而CAT基因表现更为灵敏的情况，一方面可能与抗氧化酶类基因受底物浓度调控相关，CAT负责SOD下游程序，此处可能存在类似于级联放大的作用，因此CAT基因得到的信号强度更高，从而表现更为灵敏；另一方面，虽然生物体在针对超氧阴离子等自由基所导致的氧化损伤存在复杂的抗氧化网络与之对抗，其中仅有SOD针对超氧阴离子，其他诸如CAT和GPx以及GSH等大量抗氧化物质均作用于H2O2。现有研究也表明H2O2在机体内的扩散能力强并且其能在铁螯合物存在的情况下与超氧阴离子进一步形成更具威胁的羟自由基[28]，由此机体可能形成了对于H2O2更加灵敏的感受机制，以及更为强大的清除机制。

3.2 白藜芦醇对LPS诱导炎症的干预

炎症是机体对致炎因子的局部损伤所产生的具有防御意义的应答性反应，其发展方向与结局取决于炎症过程中损伤与抗损伤力量的对抗，炎症的发展对于疾病进程具有重要意义。

TNF-α是重要的促炎因子，现有研究表明炎症相关疾病的致死率与TNF-α水平密切相关[29]，抑制TNF-α的表达能有效的改善肝脏[30]、肾脏损伤[31]，提高脓毒症患者存活率[32]。因此对TNF-α表达的调控是抗炎药物评价的重要依据。由于细胞不能储备TNF-α，在受到刺激时才触发其被合成[33]，因此TNF-αmRNA水平能在一定程度上反应机体的炎症情况；而LPS作为触发TNF-α产生的主要刺激物之一，生物体在遭受LPS刺激时能产生大量的TNF-α；基于以上两点，作者在应用LPS构建炎症模型的基础上对TNF-αmRNA的表达情况进行了监测。结果与Palacz-Wrobel等[34]和Zhou等[35]学者在炎症相关研究中观察到的TNF-αmRNA表达上调现象一致，作者在LPS处理组中观察到了TNF-αmRNA水平的升高。而白藜芦醇对TNF-αmRNA表达的抑制与Jia等[26]、Tan等[36]和Gan等[37]人研究结果一样，由此显示白藜芦醇对于LPS诱导的TNF-αmRNA表达具有抑制作用。

TNF-α在炎症反应中的重要性，还体现在其在细胞因子网络中对炎症介质的多重调节功能，如TNF-α的自分泌诱导机制、对INF-γ、IL-1等促炎因子的促分泌作用以及对抗炎因子(如IL-10)合成的诱导作用。其中INF-γ对TNF-α生物学作用有增强作用。而IL-1不仅能增强TNF-α的生物学作用，还具有吸引嗜中性粒细胞，引起炎症介质释放和触发TNF-α产生的效果。至于IL-10，则能负向调节TNF-α的表达，对于控制炎症发展意义重大。因此本研究在检测TNF-αmRNA的同时，也对INF-γ、IL-1和IL-10基因的表达进行了监测。结果显示在LPS作用下，INF-γ和IL-1基因的表达出现了显著上调；而白藜芦醇能有效地干预这一情况。这在一方面与本研究中TNF-α基因的表现相统一，另一方面又与Tan等[36]、Gan等[37]和Chalon等[38]学者在炎症相关研究中观察到的结果一致。至于IL-10基因的表达，研究在不同处理间并未发现显著变化，这虽然与Yu等[39]提出的白藜芦醇能促进IL-10产生的情况不同，但是其变化趋势在一定程度上却体现了TNF-α对抗炎因子合成的诱导作用。本研究中白藜芦醇的应用不仅显著的降低了TNF-α基因的转录表达，对INF-γ和IL-1基因的表达也有显著的抑制效果，而IL-10基因的表达变化趋势也在一定程度上反应了其受到TNF-α刺激信号的减弱。至于白藜芦醇是否直接作用于TNF-α基因转录，是否直接或通过TNF-α间接刺激INF-γ和IL-1基因的转录表达，仍有待进一步的研究证实。就本研究的结果而言，白藜芦醇对CIK细胞IL-10基因的转录表达直接作用的可能性不大，其转录水平的变化趋势显示出其转录表达变化更可能与促炎因子TNF-α的表达水平变化相关。

综上所述，白藜芦醇对LPS诱导的CIK细胞损伤有较好的保护作用，可能主要通过提高CIK细胞的抗氧化性能、减少细胞的炎症反应实现。