酶联免疫法快速检测水产品中硝基呋喃类代谢物、氯霉素及氟苯尼考

区兑鹏，卢义博，严忠雍，张小军*

(1.浙江海洋大学食品与医药学院； 2.浙江海洋大学水产学院； 3.浙江省海洋水产研究所： 浙江 舟山316022)

硝基呋喃类药物[1]、氯霉素(CAP)[2]和氟苯尼考(FF)[3]都是广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等病原体有杀灭作用，以治疗水产品中各种传染性疾病[4-5]。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸的副作用[6]；CAP、FF能引起人的再生障碍性贫血[7]，农业农村部已将硝基呋喃类硝基呋喃类药物、CAP和FF列为养殖过程中禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出[8]。硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，其中呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃妥因代谢物(AHD)、呋喃西林代谢物(SEM)和蛋白质结合相当稳定，故常利用代谢物的检测来反映硝基呋喃类药物的残留情况[9]。

随着中国对药物残留的监督管理逐渐加强，对药物残留相关检测技术要求也更加严格。硝基呋喃类代谢物一般经衍生化后，采用液液萃取[10]、固相萃取[11]和免疫亲和色谱[12]等方法提取净化，用液相色谱法或质谱联用法进行检测[13]。目前水产品中的CAP、FF检测方法主要包括酶联免疫法[14]、液相色谱法[15]、气相色谱法[16]、气质联用法[17]和液质联用法[18]。灵敏快捷、高精密度且简便易行是酶联免疫法在药物残留分析方法发展中的主要特点[19]。硝基呋喃类代谢物、CAP和FF作为本试验的研究对象，采用酶联免疫方法定性、定量检测水产品中硝基呋喃类代谢物、CAP和FF的残留量，该方法具有精密度更高、灵敏度更高、检测时间更短、技术要求低和高通量测定等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器

Avanti JXN-30离心机(美国Beckman Coulter公司)；微量移液器(美国Thermo Scientific公司)；MK3 微孔板酶标仪(美国Thermo Labsystems 公司)；MS2漩涡混合器(德国IKA公司)；N-EVAP-45氮吹仪(美国Organomation公司)；ZO-85恒温培养箱；HH-S11.6数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)；氯霉素、氟苯尼考及硝基呋喃类代谢物试剂盒(江苏美正生物科技有限公司)。

1.2 试剂

去离子水、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、浓盐酸、氢氧化钠及三水合磷酸氢二钾，均为分析纯。

1.3 样品前处理

选择中国不同地区水产品，表面用蒸馏水清洗，晾干水分后充分匀浆。称取1 g样本，加入4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，再加入150 μL衍生化试剂，震荡摇匀2 min；在60 ℃水浴锅内孵育2 h；加入3 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液和3 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液，震荡摇匀30 s；加入10 mL乙酸乙酯，震荡摇匀1 min，室温4 000 r/min离心10 min；取5 mL上清液置于50～60 ℃氮气流下吹干；加入正己烷，再加入样本稀释液，震荡摇匀1 min；室温4 000 r/min离心5 min；除去上层有机相，取下层清液50 μL用于分析。

1.4 实验方法

加标准品或样本每微孔50 μL到对应的微孔中，再依次加入酶标物、抗试剂每微孔50 μL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于25 ℃避光环境中反应30 min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤液250 μL每孔，充分洗涤4～5次，每次隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未清除的气泡用未使用的枪头戳破)。每孔依次加入底物液A液、底物液B液各50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25 ℃避光环境中反应15 min。加入终止液50 μL 每孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处测定每孔OD值。

2 方法优化

2.1 不同提取剂对样品的影响

孙言春等[20]选择乙酸乙酯、二氯甲烷作为提取液提取水产品中硝基呋喃类代谢物，结果表明，二者作为提取剂时，回收率范围为77.3%～95.5%之间，均满足实验要求。考虑到二氯甲烷对人体和环境的毒性较大，最终选择乙酸乙酯作为提取剂。马永飞等[21]比较了3种不同的提取溶剂(乙腈、乙酸乙酯及水)对CAP提取效果的影响，发现以乙酸乙酯作为提取溶剂时，提取效果优于乙腈和水。因此，本实验选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

2.2 不同衍生化条件对样品的影响

李剑等[22]选择在37 ℃、45 ℃和60 ℃条件下分别衍生化，结果显示，在60 ℃和45 ℃的衍生条件下，能保证较好的衍生效果和重现性，考虑到效率问题，选择60 ℃的条件进行衍生化反应。周道志[23]在检测水产品硝基呋喃类代谢物实验中，经过优化，得到衍生化条件为60 ℃、1 h，与GB/T 22338—2008[24]的方法相比，两者响应强度并没有显著差异，但大幅度缩减前处理所需要的时间。本实验在50、60和70 ℃ 3个温度下分别衍生化1 h、2 h和3 h。结果显示，在衍生化条件60 ℃、2 h时样品加标回收率最高，当温度过高或过低时，AMOZ加标回收率均过低，AHD在70 ℃时加标回收率过低，因此本实验选择60 ℃、2 h进行衍生化。结果如图1所示，在60 ℃、2 h草鱼(Ctenopharyngodonidella)回收率范围为64%～144%。

图1 不同衍生化温度及时间对样品中加标回收率的影响Fig.1 The influences of different derivatization temperatures and times on the recoveries in samples

2.3 不同浓度的盐酸对样品的影响

宋瑞等[25]在GB/T 21311—2007[26]的基础上，通过优化水解衍生化条件，改变酸的浓度，提升衍生化效率的同时也提高了回收率，标准曲线线性得到明显改善。本实验比较了0.05、0.10和0.20 mol/L 3个浓度盐酸对加标回收率的影响。结果显示浓度在0.05 mol/L时，由于浓度过低，与蛋白质结合的硝基呋喃类代谢物中C=N双键不能断裂[27]，酸的浓度在0.05 mol/L时回收率过低，而CAP、FF在酸碱环境中不稳定，浓度在0.2 mol/L时回收率偏低，因此选择0.1 mol/L的酸消化为宜，当浓度在0.1 mol/L时草鱼的加标回收率范围为68.0%～146.0%。

3 结果与分析

3.1 线性范围及检出限

与国家标准(GB/T 22338—2008[24]、GB/T 21311—2007[26])中推荐的的液相色谱串联质谱法相比，酶联免疫法的检出限较低(表1、表2)，经过显色后，可以直观进行定性判断，并且可以通过酶标仪对6种分析物进行定量判断。

表1 酶联免疫法范围及检出限Tab.1 The scope and detection limit of enzyme-linked immunosorbent assay

表2 液-质串联法线性范围及检出限Tab.2 The linear range and detection limit of liquid-mass tandem method

3.2 加标回收率与精密度

分别取大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)、鲫(Carassiusauratus)和贻贝(Mytilusedulis)等样本，平行测定5次，计算回收率和精密度(RSD)。结果见表3～表8，6种分析物平均回收率均在60%～144%之间，RSD为0～7.5%。由于FF在酸性条件下能稳定存在，但在碱性条件下不稳定[28]，在前处理过程中，参照南琼等[29]用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH至弱酸性，导致FF回收率偏低，但回收率均在60%以上，符合检测标准。

表3 氯霉素的回收率和相对标准偏差Tab.3 The recovery and relative standard deviation of chloramphenicol n=5

表4 氟苯尼考的回收率和相对标准偏差Tab.4 The recovery and relative standard deviation of florfenicol n=5

表5 呋喃唑酮代谢物的回收率和相对标准偏差Tab.5 The recovery and relative standard deviation of furazolidone n=5

表6 呋喃西林代谢物的回收率和相对标准偏差Tab.6 The recovery and relative standard deviations of furacillin n=5

表7 呋喃妥因代谢物的回收率和相对标准偏差Tab.7 The recovery and relative standard deviation of furantoin n=5

表8 呋喃它酮代谢物的回收率和相对标准偏差Tab.8 The recovery and relative standard deviation of furanone n=5

3.3 基质效应

在实验过程中发现中国对虾(Penaeusorientalis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)加标回收率存在偏高或偏低现象。用公式(1)进行基质效应的计算。样品添加浓度为CAP：0.54 ng/mL、FF：2.7 ng/mL、SEM：0.81 ng/mL、AOZ：0.81 ng/mL、AHD：1.35 ng/mL、AMOZ：1.35 ng/mL。B/A>1表示基质增强，B/A<1则表示基质减弱。如表9所示，硝基呋喃类代谢物表现为基质增强，基质效应在3.720～5.921之间；CAP、FF表现为基质减弱，基质效应在0.497～0.622之间。倪永付等[30]研究表明，硝基呋喃类代谢物存在非外源性来源，有些虾蟹类水产品能够自身产生硝基呋喃类代谢物，从而产生基质增强效应。由于CAP、FF在中性、弱酸性条件较稳定，但在强酸性、碱性条件下不稳定，在前处理过程中使用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH，导致基质减弱[31]。

Matrix Effect=B/A×100%

式(1)

式中：A表示纯溶剂中农药含量(μg/kg)，B表示样品基质中添加的相同农药含量(μg/kg)。

表9 基质效应Tab.9 The matrix effect

3.4 实际样品测定

用该方法对中国不同地区(福建、山西和浙江)，各20个水产品样本：鲈(Percafluviatilis)、鳊(Parabramispekinensis)、鲤(Cyprinuscarpio)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、黄姑鱼(Nibeaalbiflora)、大黄鱼、中国对虾等进行检测，结果如表10所示。取自太原的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、绍兴的鲤和鳊检测出CAP超标；福州的加州鲈、舟山的中国对虾检测出AOZ超标，其他代谢物均未检出。表明目前中国水产品市场CAP 以及硝基呋喃类代谢物AOZ仍存在风险，但风险可控。

表10 实际样品测定Tab.10 The determination results of the actual samples

4 结论

本研究经过方法优化,条件为0.1 mol/L盐酸、60 ℃孵育2 h、经乙酸乙酯提取时，可同时快速检测6种物质残留量，且回收率在60%～144%之间；检出限分别为CAP：0.04 μg/kg、FF：0.2 μg/kg、AOZ：0.1 μg/kg、AHD：0.2 μg/kg、AMOZ：0.1 μg/kg、SEM：0.1 μg/kg。利用本方法对中国不同地区水产品进行检测，结果与液质串联法基本一致。在原有的检测标准上，本试剂盒方法在45 min内即可以完成操作，缩短检测时间，简化了实验步骤，提高实验效率。在实验设备不能满足的条件下可以通过显色后，根据每孔颜色深浅定性判断，也可以通过酶标仪测定6种分析物的定量残留结果，灵敏度和准确度满足日常水产品等动物源性食物组织中6种分析物的快速检测和大批量样品的初步批量筛查，为上机实验提供了有利的条件，减少了上机实验负担。该方法在缺乏大型精密检测设备的基层也可完成操作，可用于大范围推广。